貴州省地方品種雞禽白血病病毒流行毒株的亞型鑒定及其分子特征分析.pdf

1、禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leucosis Virus, ALV)引起的一種垂直傳播性疾病，能夠引發(fā)雞群產(chǎn)生良性和惡性腫瘤，導(dǎo)致其生產(chǎn)性能下降和免疫抑制。ALV可以分為A-J十個亞群，以及新鑒定的K亞群。其中，J亞群禽白血病是由J亞群禽白血病病毒（ALV-J）在雞群中引起的以髓細(xì)胞樣細(xì)胞瘤為主要病理表現(xiàn)的腫瘤病，其發(fā)生率最高，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大損失。到目前為止，無任何可預(yù)防和治療的藥物，為減輕該病毒對養(yǎng)雞業(yè)的危害，不斷加強對

2、各省市地方品種雞群AL的凈化工作成為重中之重。
　　近年來，ALV不僅在羅曼褐蛋雞、海蘭蛋雞中流行，而且在我國各地區(qū)不同品種雞中廣泛傳播，影響了我國地方品種雞的健康發(fā)展。貴州省處于云貴高原東部，水草豐沛，生態(tài)氣候條件優(yōu)越，孕育了黔東南小香雞，威寧雞、竹香雞和長順綠殼蛋雞等優(yōu)良貴州地方品種雞，是我國雞種資源基因庫的寶貴資源。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，我國在2005年和2008年有關(guān)于貴州省部分地方規(guī)模化養(yǎng)殖場雞群AL的相關(guān)報道，但近年來貴州省地方

3、品種雞群AL的病原學(xué)調(diào)查研究較少。為了解2016年貴州省地方品種雞AL感染情況及其主要流行亞型，本研究通過對2016年2月至4月份采集的貴州省八個地區(qū)9個地方品種雞雞蛋樣品，進行ALV的病原學(xué)檢測和確定其主要流行亞型，完成對貴州省地方品種雞ALV感染情況探究。
　　為了解貴州省ALV感染情況，利用ALV-P27抗原ELISA檢測試劑盒對貴州省八個地區(qū)威寧雞，竹香雞、長順綠殼雞及部分地方土雞等9個地方品種雞380份雞蛋進行檢測。采集

4、卵白，使用ALV-P27抗原檢測試劑盒檢測卵白中ALV群特異性P27抗原，結(jié)果顯示貴州省八個地區(qū)的卵白中ALV-P27抗原陽性率為14.7％（56/380），其中安順、遵義、六盤水、長順、黔東南五個地區(qū)的品種雞群有禽白血病感染，貴陽、黔西南、畢節(jié)三個地區(qū)的品種雞群未發(fā)現(xiàn)有禽白血病感染，而來自安順、長順、遵義三個地區(qū)的綠殼蛋雞ALV陽性率較高，為26.7%~36%。
　　將卵白ELISA試劑盒檢測ALV-P27抗原為陽性的56份樣品

5、，分別接種CEF和DF-1細(xì)胞培養(yǎng)后，使用ELISA、IFA、PCR以及卵白中提取RNA進行RT-PCR檢測方法進行重復(fù)驗證，探究同一批ALV陽性樣品不同實驗方法的復(fù)核結(jié)果。結(jié)果顯示，DF-1和CEF細(xì)胞的檢測結(jié)果相同，有15個樣品為陽性，陽性率為26.8%（15/56），表明存在外源性ALV，細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞上清中ALV-P27抗原的檢出率降低，可能因為在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒量達(dá)不到ELISA方法檢出ALV-P27抗原的

6、最低病毒量。本結(jié)果為禽白血病凈化方法的進一步完善提供了重要的數(shù)據(jù)，我們建議在AL凈化時，如果條件允許應(yīng)該增加樣品細(xì)胞培養(yǎng)后的PCR方法檢測，有利于降低ALV的漏檢率。同時使用Trizol法和組織RNA提取試劑盒兩種方法提取卵白RNA，將提取好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR檢測均未檢測到ALV，可能由于卵白中RNA病毒含量較少，這種檢測方法目前還不能用于生產(chǎn)中陽性樣品的復(fù)核。
　　卵白ELISA試劑盒檢測ALV-P27抗原為陽

7、性的樣品，分別接種CEF和DF-1細(xì)胞培養(yǎng)來分離病毒，7d后檢測細(xì)胞上清中ALV-P27抗原、感染細(xì)胞cDNA用4對ALV引物進行PCR鑒定與分型。并選取9個雞群的部分ALV分離株進行g(shù)p85基因的克隆測序與序列分析。結(jié)果表明，56個陽性卵白的細(xì)胞培養(yǎng)上清陽性率為26.8%（15/56）；56個陽性卵白接種的CEF和DF-1均擴增出ALV，并鑒定出其亞型全部為J亞型（ALV-J）。已測序的21株ALV-J gp85基因同源性比較表明，分