豬弓形蟲(chóng)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的鑒定及功能分析.pdf

1、弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是能夠感染真核細(xì)胞的頂器門寄生原蟲(chóng)，呈世界性分布，宿主范圍廣，傳播途徑多樣，生活史復(fù)雜?？蓪?dǎo)致孕婦流產(chǎn)，新生兒先天性疾病，以及繼發(fā)免疫抑制患者致死性疾病。弓形蟲(chóng)可致家畜流產(chǎn)和生長(zhǎng)發(fā)育不良，給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)攝食被弓形蟲(chóng)污染的肉類可使人感染弓形蟲(chóng)病。豬肉是人類主要的肉食來(lái)源之一，豬的弓形蟲(chóng)感染嚴(yán)重威脅人類的生命健康。弄清弓形蟲(chóng)的致病機(jī)理和開(kāi)發(fā)安全有效的疫苗是預(yù)防和控制人類和動(dòng)物弓形蟲(chóng)

2、病的基礎(chǔ)和重要手段。
　　 為此，本研究構(gòu)建了RH株弓形蟲(chóng)速殖子cDNA表達(dá)文庫(kù)，利用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(IVIAT)，鑒定出14個(gè)豬弓形蟲(chóng)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-timePCR)對(duì)其中5個(gè)抗原基因進(jìn)行了體內(nèi)、外表達(dá)差異的驗(yàn)證和體外原核表達(dá);對(duì)弓形蟲(chóng)鈣調(diào)蛋白(CaM)基因進(jìn)行了RNA干擾(RNAi)，評(píng)價(jià)其表達(dá)下調(diào)對(duì)弓形蟲(chóng)速殖子滑行運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘附、入侵和溢出及胞內(nèi)繁殖等表型的影響;以弓形蟲(chóng)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原微線體

3、蛋白11(MIC11)α鏈構(gòu)建了DNA疫苗，并在BALB/c鼠模型中檢測(cè)到保護(hù)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。
　　 (1)豬弓形蟲(chóng)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因的篩選與鑒定
　　 大量收集并純化RH株弓形蟲(chóng)速殖子，提取總RNA，利用商業(yè)化SMARTTM技術(shù)構(gòu)建以噬菌體為載體的cDNA表達(dá)文庫(kù)。構(gòu)建的文庫(kù)重組率達(dá)到98％以上，初始文庫(kù)和擴(kuò)增文庫(kù)滴度分別為2.1×106pfu/mL和1.6×109pfu/mL，文庫(kù)容量為3.2×1011個(gè)重組子?；旌?/p>

4、10份豬弓形蟲(chóng)陽(yáng)性血清并通過(guò)逐級(jí)吸附弓形蟲(chóng)速殖子全細(xì)胞、超聲破碎裂解液和熱裂解物，去除血清中體外弓形蟲(chóng)抗體。運(yùn)用吸附后血清對(duì)表達(dá)文庫(kù)的3264個(gè)克隆進(jìn)行免疫篩選，得到14個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)篩選得到的體內(nèi)誘導(dǎo)抗原進(jìn)行EST序列分析和功能預(yù)測(cè)，14個(gè)抗原中包括涉及離子/蛋白結(jié)合、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白折疊、細(xì)胞入侵和生物合成與代謝等8個(gè)功能蛋白，同時(shí)包括6個(gè)未知功能的假定蛋白。
　　 (2)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原體內(nèi)外表達(dá)差異的驗(yàn)證及原核表達(dá)
　　

5、 選擇其中5個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因，即CaM、致密顆粒蛋白5(GRA5)、MIC11、18KDa親環(huán)蛋白(C-18)和絲氨酸蛋白酶抑制劑(PI)，針對(duì)各自的ORF設(shè)計(jì)引物，real-timePCR檢測(cè)感染BALB/c鼠72h和在BHK細(xì)胞中培養(yǎng)72h的速殖子中，5個(gè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的差別。結(jié)果顯示，宿主體內(nèi)速殖子中5個(gè)基因mRNA表達(dá)量均高于體外培養(yǎng)速殖子中表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著(p＜0.05)。其中CaM基因體內(nèi)、外mRNA

6、相對(duì)表達(dá)量差異最大，可達(dá)15.04倍。利用5個(gè)基因全長(zhǎng)CDS序列設(shè)計(jì)原核表達(dá)引物，分別克隆各自O(shè)RF片段，連接原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，形成重組GST融合表達(dá)質(zhì)粒。除pGEX-6p-1/GRA5表達(dá)失敗以外，其余4個(gè)重組質(zhì)粒均可在E.coliBL21系統(tǒng)中高效表達(dá)。分別利用弓形蟲(chóng)陽(yáng)性豬血清和商業(yè)化GST一抗血清對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot分析，4個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原均具有良好抗原性，且CaM和C-18抗原性較強(qiáng)。
　　

7、 (3)弓形蟲(chóng)CaM的下調(diào)表達(dá)對(duì)速殖子表型的影響
　　 針對(duì)弓形蟲(chóng)CaM基因序列不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA(siRNA707，siRNA865，siRNA900)，對(duì)CaM的表達(dá)進(jìn)行體外干擾。利用real-timePCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平干擾效果，結(jié)果顯示，3對(duì)siRNA對(duì)弓形蟲(chóng)CaM的表達(dá)均有一定程度的干擾，對(duì)其他與弓形蟲(chóng)CaM有同源性的基因無(wú)干擾作用，表明干擾特異性強(qiáng)，無(wú)脫靶效應(yīng)。確定siRNA最優(yōu)作用時(shí)間為24h，最佳工作濃度為

8、200nmol/L。用鼠抗弓形蟲(chóng)CaM多克隆抗體對(duì)干擾前后速殖子進(jìn)行Western-blot，檢測(cè)蛋白質(zhì)水平干擾效果。三對(duì)siRNA中，siRNA900在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平上干擾效果最顯著。在BHK細(xì)胞模型中，觀察CaM被干擾后弓形蟲(chóng)速殖子表型的變化。結(jié)果顯示，弓形蟲(chóng)CaM的表達(dá)下調(diào)顯著降低速殖子的細(xì)胞粘附、入侵和溢出能力(p＜0.05)，但對(duì)其胞內(nèi)繁殖無(wú)影響(p＞0.05)。
　　 (4)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原MIC11免疫原性的研究<

9、br>　　 將弓形蟲(chóng)MIC11-α鏈基因片段與真核表達(dá)載體pcDNA3.1連接，構(gòu)建DNA疫苗pcDNA3.1/MIC11。間接免疫熒光(IFA)證明重組質(zhì)粒在BHK細(xì)胞中可高效表達(dá)，并能被弓形蟲(chóng)多克隆抗血清特異性識(shí)別。重組質(zhì)粒100μg免疫BALB/c小鼠，同時(shí)，設(shè)相同劑量pcDNA3.1空載體和100μLPBS陽(yáng)性對(duì)照組。首次免疫后兩周，利用TLA-ELISA可在pcDNA3.1/MIC11免疫鼠血清中檢測(cè)到特異性TLA抗體，隨免

10、疫時(shí)間延長(zhǎng)，抗體水平持續(xù)升高，對(duì)照組無(wú)抗體產(chǎn)生。細(xì)胞因子ELISA結(jié)果證明，構(gòu)建的DNA疫苗可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的IL-2、IL-12及IFN-γ，但對(duì)IL-4無(wú)刺激作用。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，pcDNA3.1/MIC11免疫鼠淋巴細(xì)胞增殖水平顯著高于空載體組(p＜0.05)和PBS對(duì)照組(p＜0.05)。免疫后第8周，小鼠腹腔接種RH株弓形蟲(chóng)速殖子，對(duì)照組小鼠在10天內(nèi)全部死亡，而疫苗組小鼠在攻蟲(chóng)后15天仍有17％的存活率。以上結(jié)