凡納濱對蝦造血激素、F1Fo-ATP合酶β亞基和WSSV-VP37的相互作用研究.pdf

1、白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是養(yǎng)殖對蝦的主要病毒性病原之一，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。病毒感染是從病毒黏附蛋白與宿主表面受體相互作用開始的，因此研究病毒與宿主相互作用具有重要意義。在前期對WSSV與宿主相互作用蛋白的鑒定研究中，發(fā)現(xiàn)F1-ATP合酶β亞基可能以受體身份參與了WSSV的感染。Lin等發(fā)現(xiàn)F1-ATP合酶β亞基與造血激素（astakine，AST）存在特異性的結(jié)合作用。A

2、ST作為一種在甲殼動物中具有促進造血組織細胞分化和增殖的細胞因子，在太平洋蝲蛄中也被發(fā)現(xiàn)添加該蛋白可以促進WSSV在造血細胞中增殖。F1-ATP合酶β亞基（ATPsyn-β）和造血激素都與WSSV感染密切相關(guān)，為進一步了解兩蛋白在功能上的相互關(guān)系，解析其與WSSV的粘附蛋白VP37之間作用機制。本文通過Far-Western、免疫熒光定位法、原子力技術(shù)等，分別從蛋白水平和細胞水平鑒定了AST、ATPsyn-β和VP37之間的相互作用關(guān)系

3、，為探討WSSV感染宿主的分子機制提供理論基礎(chǔ)。
　　本研究共分為4部分：利用酶聯(lián)免疫結(jié)合法、Far-Western技術(shù)及競爭結(jié)合法在蛋白水平上鑒定AST、ATPsyn-β和VP37之間的相互作用關(guān)系；利用實時熒光定量PCR和免疫熒光組織化學染色及細胞熒光免疫染色的方法對LvAST和ATPsyn-β進行組織分布和細胞定位分析；利用激光共聚焦顯微鏡，運用免疫熒光組織化學染色和細胞熒光免疫染色的方法在細胞水平上進行LvAST、ATPs

4、yn-β和VP37、ATPsyn-β共定位及競爭抑制關(guān)系分析；利用原子力技術(shù)在納米水平獲取正常對蝦血淋巴細胞及WSSV感染后細胞的形態(tài)變化并進行原子力顯微鏡探針標記及其對LvAST、VP37和ATPsyn-β的結(jié)合關(guān)系驗證。
　　1.蛋白水平上LvAST、VP37、ATPsyn-β的結(jié)合活性分析：誘導表達并純化LvAST、VP37和F1Fo-ATP synthase重組蛋白，運用ELISA結(jié)合實驗、Far-Western的方法及競

5、爭結(jié)合實驗檢測三蛋白的相互作用關(guān)系。研究結(jié)果表明，ATPsyn-β是LvAST和VP37共有的結(jié)合蛋白，而重組LvAST和VP37蛋白并不具有直接的結(jié)合作用；LvAST與VP37相互競爭抑制對方與ATPsyn-β的結(jié)合，并且這種競爭抑制作用與LvAST、VP37的蛋白量正相關(guān)。
　　2.LvAST和ATPsyn-β的組織分布和細胞定位分析：經(jīng)實時熒光定量PCR檢測表明LvAST在血淋巴細胞、肝胰腺、肌肉、淋巴器官和鰓中均有表達，與

6、免疫熒光組織化學方法的檢測結(jié)果相符；經(jīng)熒光強度定量分析發(fā)現(xiàn)LvAST在肝胰腺和鰓中分布最多；經(jīng)免疫熒光技術(shù)在細胞水平進一步檢測LvAST在血淋巴細胞的分布，結(jié)果表明該蛋白不僅在血淋巴細胞內(nèi)存在，并且在血淋巴細胞外膜上有分布；免疫熒光組織化學方法的檢測ATPsyn-β也具有組織分布的廣譜性，并在鰓和肝胰腺組織中中含量較高。
　　3.細胞水平上LvAST、VP37和ATPsyn-β的相互結(jié)合關(guān)系分析：利用激光共聚焦顯微鏡運用細胞熒光免

7、疫和熒光免疫組織化學染色的方法分別在血淋巴細胞內(nèi)，血淋巴細胞膜上和肝胰腺組織切片上對LvAST、ATPsyn-β和ATPsyn-β、VP37進行共定位和競爭作用分析。研究結(jié)果表明：三者在細胞水平和組織水平均具有空間分布的一致性，并且LvAST和VP37相互競爭與ATPsyn-β的結(jié)合，同時LvAST能夠競爭抑制WSSV對ATPsyn-β的結(jié)合。
　　4.原子力顯微鏡獲取對蝦血淋巴細胞在正常及WSSV感染后的形態(tài)變化：
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8、1）利用原子力顯微鏡以AAC模式和MAC模式分別對空氣中液體狀態(tài)中的正常凡納濱對蝦血淋巴細胞進行表征掃描ATPsyn-β。并在AAC模式下對WSSV感染的血淋巴細胞進行表征掃描，以獲取差異性特征信息。結(jié)果在MAC模式下掃描得到的血淋巴細胞可分為兩類，A類細胞較大，平均大小為24×8μm，平均高度為531nm，B類細胞平均大小為16×14μm，平均高度為564nm；AAC模式下也可以掃描到兩類大小不同的細胞，但細胞高度均有縮減，其中A類細

9、胞平均高度為454nm，B類細胞平均高度為284nm。究其原因，可能是細胞干燥失水所致。這一結(jié)果為凡納濱對蝦血淋巴細胞的分類提供了一定的數(shù)據(jù)。在AAC模式下掃描WSSV感染的血淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)細胞高度明顯降低至283nm和208nm，并且細胞邊界和內(nèi)部結(jié)構(gòu)變模糊。
　　（2）原子力顯微鏡探針標記及其對LvAST、VP37和ATPsyn-β的結(jié)合關(guān)系驗證：對原子力顯微鏡進行探針標記，分別利用標記LvAST或VP37的探針，近一步驗證三