安徽白山羊三種經(jīng)濟(jì)性狀基因表達(dá)載體構(gòu)建及CMV啟動(dòng)子優(yōu)化研究.pdf

1、安徽白山羊是優(yōu)良的地方品種，經(jīng)過長(zhǎng)期選育，形成了耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖率高、肉和板皮質(zhì)量?jī)?yōu)的優(yōu)良特性。但是，該品種受其個(gè)體小、生長(zhǎng)緩慢的影響，不適于廣泛推廣，迫切需要改良以提高其生長(zhǎng)速度。目前，通過轉(zhuǎn)基因育種提高其生長(zhǎng)速度是改善其生產(chǎn)性能的重要途徑之一。為了實(shí)施該育種途徑，必須具有促進(jìn)生長(zhǎng)性能的基因及其高效的真核表達(dá)載體。基于這一需求，本論文在農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因山羊育種重大專項(xiàng)的資助下，進(jìn)行了安徽白山羊重要促生長(zhǎng)基因的克隆和真核表達(dá)載體構(gòu)建的

2、研究。
　　本論文首先根據(jù)物種間基因序列的保守性，設(shè)計(jì)了從mRNA擴(kuò)增生長(zhǎng)激素(growthhormone，GH)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（insulin-likegrowthfactor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）及生長(zhǎng)抑素（somatostatin,SST）基因的PCR引物，之后從安徽白山羊的垂體、肝臟及胰臟組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后作為模板，用所設(shè)計(jì)的特異引物成功擴(kuò)增出三種目的基因片段，再將三種基因片段進(jìn)行T克隆及測(cè)序。經(jīng)確認(rèn)的基因片

3、段再接入真核表達(dá)載體pEGFP-N1，構(gòu)建了pEGFP-N1-GH、pEGFP-N1-IGF-Ⅰ及pEGFP-N1-SST真核表達(dá)載體。之后，經(jīng)菌落PCR、酶切及測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建三種基因的真核表達(dá)載體。為了檢測(cè)三種真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因可行性，用脂質(zhì)體將三種基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的安徽白山羊胎兒成纖維細(xì)胞，通過熒光顯微鏡直接觀察和RT-PCR檢測(cè)，確證目的基因GH、IGF-Ⅰ及反義SST在山羊胎兒成纖維細(xì)胞中表達(dá)，并篩選出穩(wěn)定表

4、達(dá)GH、IGF-Ⅰ基因以及SST反義基因的成纖維細(xì)胞克隆?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)，成功克隆了安徽白山羊三種重要的經(jīng)濟(jì)性狀基因，即GH、IGF-Ⅰ和SST基因，并成功構(gòu)建了其直接可用于轉(zhuǎn)基因育種的真核表達(dá)載體，從而為安徽白山羊轉(zhuǎn)基因育種提供了重要的遺傳素材。
　　為了探討可用于轉(zhuǎn)基因育種的更高效的真核表達(dá)載體，本論文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室近年來進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜研究成果，對(duì)目前轉(zhuǎn)基因育種中普遍使用的真核啟動(dòng)子——巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(Cytomegaov

5、iynspromoter，CMVpromoter)進(jìn)行了序列改造，成功發(fā)展出兩種具有不同轉(zhuǎn)錄時(shí)效的高啟動(dòng)活性啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)分析表明，兩種啟動(dòng)子都有較野生型CMV啟動(dòng)子更強(qiáng)的基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)活性，可使綠色熒光蛋白報(bào)告基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)水平分別提高259.42％和164.67％。此外，研究表明兩種人造啟動(dòng)子分別具有瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的不同應(yīng)用價(jià)值。上述研究表明，成功發(fā)明了兩種高效的人造真核啟動(dòng)子，這一研究成果具有很大的應(yīng)用價(jià)值，可用