Hypodermins A，B，C基因cDNA在大腸桿菌中的表達(dá)及牛皮蠅蛆病ELISA診斷方法的建立.pdf

1、牛皮蠅蛆病是一種危害嚴(yán)重的人畜共患病，每年都給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外研究表明紋皮蠅Hypoderomin A(HA)，Hypodermin B(HB)和Hypodermin C(HC)是該病血清學(xué)診斷和免疫疫苗的候選抗原．由于獲得牛皮蠅蛆Ⅰ期幼蟲(chóng)比較困難，利用蟲(chóng)體粗蛋白作為抗原在血清學(xué)診斷和免疫防治中的研究越來(lái)越少。為了獲得較多的、純化的重組蛋白，本課題進(jìn)行了牛皮蠅Ⅰ期幼蟲(chóng)三種免疫相關(guān)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化，并建立了牛皮

2、蠅蛆病的ELISA診斷方法，為以后進(jìn)一步的研究奠定了基礎(chǔ)。 本研究從紋皮蠅Ⅰ期幼蟲(chóng)中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)Genbank上的Hypodermins A，B，C基因序列設(shè)計(jì)上下游引物，PCR擴(kuò)增HA，HB和HC基因，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T simple vector載體上并進(jìn)行序列測(cè)定。序列測(cè)定正確的目的片段(HA、HB、HC)亞克隆到原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)載體(pETHA、pETHB、pETHC)并轉(zhuǎn)

3、化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中。以優(yōu)化的表達(dá)條件誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，Western-blotting檢測(cè)重組蛋白的免疫活性。三種重組表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，提取重組蛋白包涵體，經(jīng)8M尿素變性，透析復(fù)性或SEC柱上復(fù)性后，再以葡聚’糖凝膠Sephadex G-75進(jìn)行純化。分別以蟲(chóng)體粗蛋白和純化的重組蛋白為檢測(cè)抗原，建立牛皮蠅蛆病的血清學(xué)診斷方法。經(jīng)研究得到如下結(jié)果： 1．從紋皮蠅Ⅰ期幼蟲(chóng)中提取了總RNA，用RT-P

4、CR技術(shù)擴(kuò)增獲得了HA、HB和HC基因cDNA，大小分別為697bp、697bp和715bp。 2．分別將HA、HB、HC基因cDNA與克隆載體pMD19-T連接，構(gòu)建了重組克隆載體pTHA、pTHB和pTHC。 3．序列分析表明，HA基因序列同GenBank上公布的兩個(gè)序列(登錄號(hào)：L24914，X74303)核苷酸同源性分別為100％和99.71％：氨基酸同源性分別為100％和99.56％。HB基因序列同GenBan

5、k上公布的三個(gè)序列(登錄號(hào)：L24915，X74304，X74305)核苷酸同源性分別為98.97％、98.97％和95.74％：氨基酸同源性分別為98.23％、98.23％和93.36％。HC基因序列同GenBank上公布的兩個(gè)序列(登錄號(hào)：AB054066，X74306)核苷酸同源性分別為100％和99.42％：氨基酸同源性分別為100％和99.57％，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所采集的蟲(chóng)株與國(guó)外報(bào)道的蟲(chóng)株有很高的同源性。 4．成功構(gòu)建了原

6、核表達(dá)載體pETHA、pETHB和pETHC，并實(shí)現(xiàn)了HA、HB和HC在大腸桿菌中的表達(dá)，重組蛋白均以包涵體的形式存在，表達(dá)量分別達(dá)到全菌蛋白的35％、30％和30％。 5．Western blotting結(jié)果表明，重組蛋白rHA、rHB和rHC能與牛皮蠅蛆感染牛血清IgG特異性結(jié)合，表明表達(dá)產(chǎn)物具有免疫活性。 6．重組蛋白rHA、rHB和rHC分別以0.2mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的初始濃度透析復(fù)性

7、，并在Sephadex G-75層析柱上得到了純化。 7．對(duì)重組蛋白rHA、rHB、rHC在SEC柱上的復(fù)性進(jìn)行了探索性研究，三種重組蛋白均能在SEC柱上復(fù)性。 8．分別以蟲(chóng)體粗蛋白和重組蛋白rHC作為檢測(cè)抗原建立了牛皮蠅蛆病的ELISA檢測(cè)方法，特異性分別為100％和95.8％，敏感性分別為98.36％和100％。 9．以蟲(chóng)體粗蛋白和rHC建立的ELISA診斷方法檢測(cè)采集于內(nèi)蒙古地區(qū)的233份牛血清，感染率分別