花生AhFAD2基因的RNAi抑制表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花生(Arachis hypogaea L.)起源于南美洲,是世界第四大含油種子作物.花生油主要由棕櫚酸,油酸和亞油酸組成.油類中多不飽和脂肪酸的含量、組成和生理狀態(tài)是油類品質(zhì)最重要的決定因素.植物油富含油酸,是比富含多不飽和脂肪酸的油類更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品.高油酸、低多不飽和脂肪酸的油類便于貯藏,對人體健康大有益處,是商業(yè)和營養(yǎng)上所需要的.△<'12>-油酸脫氫酶(△<'12>-oleicacid desaturase,FAD2)向脂肪酸碳鏈

2、上引入第二個(gè)雙鍵,是促進(jìn)油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關(guān)鍵酶.FAD2基因開放讀碼框(ORF)為1140bp,編碼379個(gè)氨基酸,它包含一個(gè)內(nèi)含子,位于編碼區(qū)3'末端.花生中存在兩個(gè)FAD2同源基因(AhFAD2A.AhFAD2B),它們可能是來自原始二倍體起源種的同源基因.ahFAD2A的突變和ahFAD2B轉(zhuǎn)錄物水平的大量降低共同造成了花生品種中的高油酸表型,并且一個(gè)編碼功能性酶的表達(dá)基因似乎對正常油酸表型是足夠的.FAD2基因的表達(dá)水平還受溫

3、度影響.總之,FAD2A、FAD2B這兩個(gè)同功酶基因是控制油酸含量的關(guān)鍵酶基因,但可能其他酶基因或多種調(diào)控機(jī)制也起著重要作用.FAD2在微生物工程、油料作物基因工程和植物油質(zhì)改造等方面成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一. 本試驗(yàn)將倒位重復(fù)的△12脂肪酸脫氫酶基因AhFAD2片段與經(jīng)改造的含CaMV35S啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCAMBIAl302相連,構(gòu)建了載體pCSF;將倒位重復(fù)的AhFAD2基因與種子特異性表達(dá)的大豆凝集素啟動(dòng)子相連連接到表達(dá)

4、載體pCAMBIAl300中,構(gòu)建了載體pCLF,將兩個(gè)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404和EHAl05,以山東主產(chǎn)大花生魯花14號和豐花1號成熟種子的上胚軸和子葉為受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,實(shí)現(xiàn)該倒位重復(fù)基因片段對花生中AhFAD2基因表達(dá)的抑制.由于在雙子葉植物,特別是花生中,使用潮霉素做篩選劑的少有報(bào)道,且不同品種花生、花生不同部位對潮霉素濃度的敏感度差異較大,因此在進(jìn)行花生的遺傳轉(zhuǎn)化之前,我們設(shè)計(jì)了一組梯度篩選試驗(yàn).最終確定花生胚軸轉(zhuǎn)化體

5、系的篩選濃度為潮霉素25mg/L,子葉轉(zhuǎn)化體系的篩選濃度為潮霉素10mg/L,即為篩選劑的基礎(chǔ)壓力.此外,不同農(nóng)桿菌菌株對不同植物的轉(zhuǎn)化效率差異很大.曾有報(bào)道指出農(nóng)桿菌LBA4404和EHA105對花生具有較高的轉(zhuǎn)化效率,為確定哪種對花生轉(zhuǎn)化效率更高,我們選取了這兩種菌株進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示與LBA4404 42.01﹪的轉(zhuǎn)化率相比,EHA105對花生具有更高的轉(zhuǎn)化率,可達(dá)48.74﹪.經(jīng)潮霉素選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng),獲得了轉(zhuǎn)化植株400

6、余株,其中CaMv35S啟動(dòng)子啟動(dòng)的180余株,種子特異性表達(dá)的大豆凝集素啟動(dòng)子啟動(dòng)的230余株.我們對轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行了分子生物學(xué)的驗(yàn)證,PCR結(jié)果顯示,CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的植株和種子特異性表達(dá)的大豆凝集素啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的植株均有大部分?jǐn)U增出372bp的特異性目的條帶,表明△<'12>脂肪酸脫氫酶基因 AhFAD2的RNAi抑制表達(dá)框架已整合進(jìn)花生中.PCR Southern結(jié)果表明,野生型植株(對照)沒有明顯的雜交信號,轉(zhuǎn)基因株

7、系有強(qiáng)陽性信號. 作為對照,我們同時(shí)培養(yǎng)了未經(jīng)轉(zhuǎn)化的再生苗.與再生植株相比經(jīng)篩選獲得的轉(zhuǎn)化苗部分植株表現(xiàn)畸形,出現(xiàn)葉片皺縮濃綠,基部膨大,果枝間距縮短,不能正常生根等現(xiàn)象,其余雖形態(tài)正常但大都生長緩慢,莖稈弱小,嘗試了多種方法進(jìn)行改進(jìn),但效果不太理想.脂肪酸代謝是生物體基本生命活動(dòng)之一,脂肪酸是膜脂結(jié)構(gòu)的重要組成部分,這些現(xiàn)象也許是由于抑制了△<'12>脂肪酸脫氫酶基因所引起的,但是也有報(bào)道指出潮霉素對組培植株的生長發(fā)育具有很多