綿羊羊膜上皮細胞的分化潛能及在骨缺損模型治療中的應用.pdf

1、羊膜上皮細胞（amnion epithelial cells，AECs）是由廢棄的胎盤羊膜衍生的具有干細胞特性的細胞。AECs不僅具有多向分化潛能，而且許多研究都證實其具有免疫豁免性，移植后不產(chǎn)生免疫排斥反應，因缺乏末端轉(zhuǎn)移酶端粒，移植后不致瘤，再加上來源廣、易獲得，不存在倫理爭議等，而成為細胞研究工作者的研究熱點之一。應用AECs進行一些疑難癥的治療是臨床研究工作者的最終目標。臨床應用治療順利進行的前提是以安全可靠的動物實驗為基礎。目

2、前，AECs的研究主要以人的為主，在臨床治療研究中以人AECs治療肝病、肺病、心臟病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疑難病癥。而綿羊AECs的研究在國內(nèi)尚未見報道，國外的相關研究也極少。因此，本研究對綿羊AECs的分離培養(yǎng)、干細胞特性的鑒定、體內(nèi)分化及體外定向誘導分化進行了系統(tǒng)的研究。
　　1.綿羊羊膜上皮細胞的分離與培養(yǎng)
　　實驗參照人羊膜消化分離獲得原代細胞的方法，對綿羊羊膜的消化分離方法進行了探索，最終選用胰酶替代物TrypL

3、E消化綿羊羊膜分離獲得原代細胞，獲得的原代細胞活力高，純度好。細胞培養(yǎng)過程中選用了15％的胎牛血清濃度的培養(yǎng)液進行細胞的培養(yǎng)，很好地維持細胞良好的生長態(tài)勢。
　　在不同密度梯度培養(yǎng)情況下，通過觀察比較，確定了細胞接種的最適密度培養(yǎng)密度范圍。在最適密度培養(yǎng)范圍內(nèi)，進行細胞生長周期的觀察發(fā)現(xiàn)：綿羊AECs的潛伏期是1-2d，指數(shù)生長期是3-5d，以后為平臺期。
　　通過細胞凍存實驗確定了細胞的凍存方案，采用DMSO作為凍存保護劑

4、，F(xiàn)BS：DMSO=9:1的比列為凍存液，并且取-80℃到液氮的簡捷凍存途徑，有效地保存了綿羊AECs。
　　2.綿羊羊膜上皮細胞的干細胞特性的鑒定
　　采用細胞免疫熒光和RT-PCR技術分別檢測綿羊 AECs的ES細胞表面標志物Oct-4、SSEA-1、 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81及干細胞全能性相關基因Oct-4、Sox-2、Nanog和Rex-1等。檢測結(jié)果顯示綿羊AECs的Oct-4

5、、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的ES細胞標志物均有表達。干細胞全能性相關基因Oct-4、Sox-2和Rex-1表達，而Nanog基因未見表達。檢測結(jié)果提示，綿羊AECs具有干細胞特性的多向分化潛能。
　　3.綿羊羊膜上皮細胞在體外的定向誘導分化研究
　　為了檢驗綿羊AECs在體外的多向分化潛能，在一定條件下，利用一些外源因子誘導綿羊AECs向神經(jīng)系統(tǒng)細胞、成骨細胞和脂肪細胞進行

6、定向分化。然后分別用細胞免疫熒光檢測和RT-PCR技術、細胞AKP活性檢測、茜素紅染色、油紅O染色等方法進行了誘導分化細胞的鑒定。結(jié)果顯示：①神經(jīng)方向誘導分化28d后，細胞免疫熒光顯示神經(jīng)細胞特異性標志物β-III-tubulin和神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性標志物GFAP均呈陽性表達；RT-PCR顯示nestin和β-III-tubulin和MAP-2等基因均有表達。②成骨誘導分化細胞AKP活性檢測顯示，誘導分化培養(yǎng)的第28d細胞AKP活性略有

7、升高，第35d開始明顯高于對照組，而且隨培養(yǎng)時間的延長而繼續(xù)增高，誘導組和基礎培養(yǎng)組差異顯著；茜素紅染色有明顯的鈣化結(jié)節(jié)形成。③脂肪細胞誘導分化的第42d，油紅O染色觀察到有脂滴形成；細胞內(nèi)AKP活性檢測結(jié)果顯示，基礎培養(yǎng)組細胞AKP活性最高，各誘導組細胞AKP活性明顯低于基礎培養(yǎng)組。從上述鑒定中細胞的陽性及染色結(jié)果和誘導分化細胞的形態(tài)特征，可以推測本研究可以將綿羊AECs誘導分化為了表達β-III-tubulin陽性的未成熟神經(jīng)細胞及

8、MAP-2陽性的成熟神經(jīng)細胞、GFAP陽性的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，有鈣化結(jié)節(jié)形成的成骨細胞及有脂滴形成的脂肪細胞。
　　4.綿羊羊膜上皮細胞治療兔橈骨缺損模型的研究
　　國外有文獻報道，將綿羊AECs直接注射到綿羊體內(nèi)，來治療綿羊跟腱損傷的報道，且治療效果極佳。為了進一步檢驗我們獲得的綿羊AECs是否能夠在異種動物兔體內(nèi)進行分化，從而達到類似的治療效果。手術制作30只兔橈骨13mm缺損模型，隨機分成3組，即高劑量組，低劑量組和對照組

9、。將AECs處理后，按設定劑量通過靜脈注射進行細胞移植。在細胞移植前、手術后、細胞移植后2周、4周、8周拍攝X光片，細胞移植后的2周、4周、8周進行組織形態(tài)學觀察。結(jié)果提示：移植的綿羊AECs高劑量組在第8周無論從X光片還是新生骨組織切片，缺損組織都修復完好，高劑量組優(yōu)于低劑量組，低劑量組修復效果優(yōu)于對照組。因此可以推測綿羊AECs在兔橈骨缺損模型的體內(nèi)，向成骨方向進行了分化，加速了骨缺損的修復速度和質(zhì)量。提示綿羊AECs治療小段骨缺損