三種重金屬單抗的制備與抗體基因序列分析及其免疫檢測(cè)方法的建立.pdf

1、重金屬污染事件層出不窮，愈演愈烈，畜禽產(chǎn)品重金屬殘留不同程度超標(biāo)，威脅人畜健康?？焖佟⒘畠r(jià)地監(jiān)測(cè)生境中重金屬是減小其對(duì)人類及動(dòng)物危害的先決條件。建立更快速、更經(jīng)濟(jì)的免疫分析法檢測(cè)重金屬是生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要。本研究旨在建立能夠穩(wěn)定分泌高親和力和特異性抗重金屬汞、銅和鋅的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，克隆抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，建立其免疫分析方法并得到初步應(yīng)用。
　　本研究將重金屬（汞、銅和鋅）通過(guò)雙功能螯合

2、劑與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)制備了免疫抗原，與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備了檢測(cè)抗原。通過(guò)BCA法、紫外分光光度法、SDS-PAGE電泳和石墨爐原子吸收光譜法鑒定重金屬汞、銅和鋅螯合物人工抗原。用合成的免疫抗原免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分析雜交瘤細(xì)胞的染色體，鑒定。通過(guò)抗體亞型鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的類和亞類，通過(guò)體內(nèi)誘導(dǎo)法大量制備并純化抗體，通過(guò)間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)

3、抗體效價(jià)、親和力和細(xì)胞株分泌抗體的穩(wěn)定性，間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA（IC-ELISA）法測(cè)定抗體的特異性。通過(guò)提取雜交瘤總RNA、RT-PCR，擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，克隆測(cè)序分析該基因。采用矩陣實(shí)驗(yàn)確定抗原抗體的最佳組合，通過(guò)對(duì)封閉物、pH值、離子強(qiáng)度等影響因子的研究，確定IC-ELISA的最佳工作參數(shù)。研究結(jié)果表明：成功制備了汞、銅和鋅的免疫抗原和檢測(cè)抗原，并建立了能穩(wěn)定分泌特異性抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株分別為3G4-G5

4、、9D11-F3和Z1A5，抗體均為IgM亞類，輕鏈為kappa型，親和力達(dá)109L/mol~1010L/mol，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為1.15μM、0.257μg/mL和0.628μg/mL，與其他金屬的交叉反應(yīng)低。從雜交瘤細(xì)胞3G4-G5、9D11-F3和Z1A5中克隆得到了抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。在IC-ELISA最佳工作參數(shù)確定的情況下，建立定量測(cè)定金屬離子汞、銅和鋅的方法，檢測(cè)范圍（IC20

5、～I(xiàn)C80）分別為0.15μM～9.0μM，0.055μg/mL～1.198μg/mL和0.062μg/mL～6.341μg/mL，最低檢測(cè)限分別為3.94×10-5mM，0.0227μg/mL和0.015μg/mL。水樣中的汞、銅和鋅添加回收率為分別為88.9％～107.3%，87.4%～106.8%和88.6%～109.4%。
　　本研究成功制備了重金屬汞、銅和鋅抗原，建立了3株能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性抗重金屬汞、銅和鋅單