群勃龍殘留酶聯(lián)免疫檢測法的建立及三種β興奮劑免疫親和柱的制備.pdf

1、近年來，國內(nèi)外由食品安全引發(fā)的問題屢見報道，人們越來越多的重視食品安全。但是受到利益的驅(qū)使，但是仍然存在不法分子在食品中濫用非法添加劑，致使人民身體健康受到威脅。為了有效的保證食品安全，開發(fā)藥物殘留快速便捷的檢測方法顯得尤為重要。
　　 群勃龍(Trenbolone，TRE)是一種應用廣泛的甾類蛋白同化激素，它是在結(jié)構(gòu)及活性上與人體雄性激素睪酮相似的化學合成衍生物。它能促進蛋白質(zhì)合成、增進食欲、增長肌肉、促進鈣磷在骨組織中沉著，

2、臨床上可用于治療嚴重的營養(yǎng)缺乏和骨質(zhì)疏松癥等疾病，但它同時也是使用頻率最高的一類運動興奮劑。此外，在畜牧生產(chǎn)上，群勃龍在對動物疾病控制和治療上起到重要的作用。但是需要注意的是，群勃龍有嚴重的副作用，比如可以引起失眠癥，高血壓，夜間盜汗等癥狀?；谝陨先秉c，在許多國家和地區(qū)群勃龍的使用都被嚴格控制。但是受到利益的驅(qū)使，群勃龍仍然被非法使用。所以開發(fā)一個簡便，快速，靈敏的用于檢測動物組織和飼料中的群勃龍殘留的方法就顯得極為重要。
　　

3、 目前群勃龍的藥物殘留檢測方法主要包括理化方法和免疫分析法等。理化方法有HPLC、GC-MS、LC、LC-MS等。此類方法穩(wěn)定、準確，可以作為標準方法，但是儀器設備昂貴，笨重，樣品前處理復雜，不適合大規(guī)模樣品的即時檢測。免疫分析法中最常見的是酶聯(lián)免疫方法，此方法克服了以上缺點，是一種易于操作的，低成本，高效快速，準確的檢測手段。具有非常高的應用價值和使用前景。
　　 本文旨在建立動物飼料，組織及尿液中群勃龍藥物殘留的酶聯(lián)免疫檢

4、測法(ELISA)。實驗中采用琥珀酸酐法合成群勃龍半抗原，然后采用碳二亞胺法將群勃龍半抗原偶聯(lián)到載體蛋白牛血清蛋白(BSA)和血藍蛋白(KLH)上，制備包被抗原和免疫原。免疫小白鼠后，獲得了針對半抗原的高特異性單克隆抗體，并據(jù)此建立了群勃龍藥物的酶聯(lián)免疫快速檢測法(ELISA)。檢測結(jié)果如下：IC500.323ng/mL，檢測限為0.06ng/mL。同時實驗結(jié)果顯示該抗體對其他六種相似結(jié)構(gòu)的藥物交叉率很小，具有很高的特異性。另外，對動物

5、組織，尿液和飼料三種實際體系的添加回收率在82.0-83.4％，81.3-89.4％，82.7-87.2％。批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.8-12.8％，9.3-16.2％，9.1-11.2％，批間變異系數(shù)分別為10.1％，11.7％，10.1％。
　　 克倫特羅，萊克多巴胺和沙丁胺醇屬于β-興奮劑類藥物。β-興奮劑是營養(yǎng)重分配劑的一種，是一類結(jié)構(gòu)和功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物[2]。它們既可以作為獸藥治療家畜疾病，

6、還可以作為飼料添加劑加快畜禽生長，降低酮體脂肪含量，提高瘦肉率。但是，研究表明β-興奮劑能夠在動物體內(nèi)中積聚殘留。如果人長期食用含有此藥物殘留的動物性食品，就會對人肝、腎等內(nèi)臟器官造成嚴重的損害。因此世界上許多國家和地區(qū)都嚴禁在畜牧業(yè)生產(chǎn)上使用各種β-興奮劑類藥物。但是由于利益的驅(qū)使，此類藥物非法使用的情況仍時有發(fā)生。因此，研究該類藥物的殘留檢測技術(shù)迫在眉睫。
　　 目前，用于此類β-興奮劑殘留檢測的方法主要有免疫分析法，HPL

7、C，LC-MS，GC-MS等。在這些方法的樣品前處理方法中大多數(shù)采用傳統(tǒng)的SPE技術(shù)。但是值得注意的是傳統(tǒng)的SPE技術(shù)步驟較為繁瑣，而且多用到大量的有機試劑，所以方法亟待改進。
　　 本文旨在制備一種能夠同時分離富集克倫特羅，萊克多巴胺和沙丁胺醇三種藥物的免疫親和柱(IAC)。利用共價鍵和的方法將沙丁胺醇抗體、萊克多巴胺抗體與瓊脂糖凝膠4B結(jié)合，然后裝柱制得免疫親和柱。相對于SPE技術(shù)，此親和柱具備特異性，高效性以及能夠顯著降低

8、基質(zhì)效應等特點。除此之外，與HPLC-UV-FLD聯(lián)用實現(xiàn)了對克倫特羅，萊克多巴胺和沙丁胺醇三種藥物殘留的同時檢測。實驗結(jié)果如下：抗體與瓊脂糖凝膠4B的偶聯(lián)率為88.6％，對三種藥物的柱容量分別為275，232，514ng。另外，應用免疫親和柱還成功地分離提純了豬肉，豬肝，豬飼料三種實際體系中的克倫特羅，萊克多巴胺和沙丁胺醇，添加回收率為78.3-95.9％，變異系數(shù)為1.3％-5.0％。
　　 通過本課題的研究，成功合成了群勃