兩類手性農(nóng)藥的對映體拆分及對映體選擇性毒理研究.pdf

1、目前，世界上所使用的手性農(nóng)藥已達到了40％，而且這一比例還在逐年增加。同一手性農(nóng)藥各個對映異構(gòu)體不僅對靶標(biāo)生物的殺蟲除草活性具有對映體選擇性，而且對非靶標(biāo)生物也會產(chǎn)生對映體選擇性的毒性。立體異構(gòu)體的分離和制備是研究手性農(nóng)藥立體選擇性構(gòu)效關(guān)系和環(huán)境行為的首要前提和基本保障，而這也是本論文研究所要攻克的難點。在本研究中，我們選擇了兩類農(nóng)藥作為研究對象，一類是有機磷農(nóng)藥（OPs）（以五個新合成的尚未商品化的且具有一定除草活性的膦酸酯類化合物以

2、及已經(jīng)商品化的敵百蟲為代表），另外一種是有機氯農(nóng)藥（OCPs）（以我們國家目前許可生產(chǎn)的唯一的有機氯殺蟲劑三氯殺蟲酯（AF）為代表）。本論文首先建立了兩類農(nóng)藥在高效液相色譜（HPLC）上的對映體分離方法。在制備得到純對映體標(biāo)樣后，研究了它們在體外模型和體內(nèi)模型上產(chǎn)生對映體選擇性毒性差異，并探討了產(chǎn)生立體選擇性毒性差異的機理。具體研究如下：
　　 用HPLC法在四根多糖類手性柱（Chiralpak AD，Chiralpak AS，

3、Chiralcel OD和Chiralcel OJ）對五個芳氧基乙酰氧基膦酸酯系列化合物進行了對映體拆分。通過條件的優(yōu)化，Chiralpak AD柱表現(xiàn)出最好的手性分離能力，它能使五個手性膦酸酯系列化合物的對映體均達到基線分離（Rs>1.5）。然后在Chiralpak AD柱上考察了流動相成分、化合物結(jié)構(gòu)式，柱溫以及流速對對映體分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同結(jié)構(gòu)的膦酸酯化合物在不同手性柱上產(chǎn)生的手性識別機制是不同的；在合適的極性調(diào)節(jié)劑類型下，

4、流動相的極性越低越有利于對映體的分離，但是對映體流出峰的時間會相應(yīng)的增加；另外這五個化合物的對映體拆分從熱力學(xué)角度分析受焓變控制的；預(yù)測出在較低的手性柱柱溫下并以異丙醇（IPA）為極性調(diào)節(jié)劑是拆分手性O(shè)Ps的優(yōu)先選擇條件。利用圓二色（CD）檢測器得到CD光譜圖來確定對映體的出峰次序。
　　 進一步借助多糖類商品化手性柱在HPLC上拆分，在前一部分得到的最佳色譜條件下制備了五個芳氧基乙酰氧基膦酸酯系列化合物的旋光異構(gòu)體標(biāo)樣。然后通

5、過在體內(nèi)水生生物大型蚤（D.magna）模型上48 h急性毒性實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此類膦酸酯系列化合物雖然在結(jié)構(gòu)上相似，但是它們對D.magna的急性毒性差異很大，并且它們對D.magna的急性毒性存在對映體選擇性差異，其中化合物3最毒，其毒性是其它化合物毒性的2～148.5倍。但是在體外乙酰膽堿酯酶（AChE）為模型的靶標(biāo)酶抑制實驗中發(fā)現(xiàn)，這五個化合物對AChE的抑制能力很小，并且對D.magna有極高毒性的化合物3對AChE的抑制并不是很

6、大，而對D.magna的毒性屬于中毒等級的化合物5，它對AChE的抑制反而相對比較大。
　　 另外我們還借助Chiralcel OJ手性柱在HPLC上拆分并制備敵百蟲的旋光異構(gòu)體標(biāo)樣。以靶標(biāo)酶AChE為體外模型進行了半抑制實驗，結(jié)果表明敵百蟲的外消旋體及其（±）-對映體對AChE的抑制存在對映體選擇性差異，毒性順序是（-）-對映體>（+）-對映體>外消旋體。另外通過敵百蟲及其各個異構(gòu)體對AChE抑制動力學(xué)研究，對反應(yīng)物和復(fù)合體間

7、的解離常數(shù)Kd，磷酸化常數(shù)Kp，雙分子反應(yīng)速率常數(shù)Ki進行計算比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敵百蟲外消旋體及其對映體對AChE的空間取向和磷酰化性能均不相同。
　　 最后我們還研究了一個DTT的替代物AF，它可能對生物體產(chǎn)生的對映體選擇性毒性。實驗以PC12細胞為體外模型，研究AF對PC12產(chǎn)生的細胞毒性和氧化應(yīng)激的對映體選擇性差異。結(jié)果表明，PC12暴露于AF24h后，S-（+）-AF，R-（-）-AF和（±）-AF使PC12細胞活性分別下降

8、了50.7％，27.5％和38.2％，在最高濃度下，LDH的釋放量也存在著明顯的對映體選擇性差異。另外，結(jié)果還表明AF對PC12產(chǎn)生的氧化損傷存在對映體選擇性差異，尤其是在高濃度下，S-（+）-AF誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生是R-（-）-AF的1.17倍，S-（+）-AF，R-（-）-AF和外消旋體使得SOD活性分別下降了32.9％，16.8％和30.2％，S-（+）-AF使得PC12的CAT的活性要明顯低于經(jīng)R-（-）-AF染毒后的CAT活性，S