應(yīng)用釀酒酵母和畢赤酵母對水稻DNA甲基轉(zhuǎn)移酶生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、DNA甲基化修飾是存在于多數(shù)真核生物中的一種重要的表觀遺傳修飾,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)在其中起著重要的作用,因此,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能及其作用機制受到越來越多的關(guān)注。
　　 本研究通過生物信息學(xué)方法預(yù)測得到水稻DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(OsDMT)編碼基因,構(gòu)建水稻DNA甲基轉(zhuǎn)移酶真核表達載體,然后將其轉(zhuǎn)化到?jīng)]有DNA甲基化背景的釀酒酵母株系A(chǔ)H109中進行表達。同時選取人類的DNA從頭甲基化酶DNMT3A、DNMT382作為實驗

2、的陽性對照。利用梯度稀釋的點板(Dotting Assay)研究外轉(zhuǎn)基因?qū)︶劸平湍窤H109生長狀態(tài)的影響,用綠色熒光蛋白檢測外轉(zhuǎn)基因在酵母中的表達情況。結(jié)果顯示:通過菌液PCR、雙酶切鑒定及測序,得到了正確重組的pBridge DNMT3A、pBridge—DNMT382、pBridge_OsDMT、pBridge_EGFP和pBridge_OsDMT_EGFP,并成功轉(zhuǎn)化到釀酒酵母AHl09中,得到陽性單克隆。梯度稀釋的點板實驗中,

3、陽性對照組DNMT3A和DNMT382對釀酒酵母AH109產(chǎn)生了生長抑制,而實驗組OsDMT對釀酒酵母的生長并無明顯抑制。外轉(zhuǎn)帶有EGFP質(zhì)粒和不帶EGFP質(zhì)粒的菌體在藍光激發(fā)下均呈綠色,尚不確定外轉(zhuǎn)基因是否被表達。使用MSAP分子標記技術(shù)對隨機選取的單克隆個體進行全基因組范圍甲基化分析,結(jié)果顯示外轉(zhuǎn)的hDNMT3A、DNMT382和OsDMT使酵母基因組DNA甲基化升高。但也發(fā)生了極個別去甲基化的現(xiàn)象,這有可能是細胞分裂過程中產(chǎn)生的序