孕鼠脂多糖暴露致子代腎臟組織DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)變化的初步研究.pdf

1、目的:
　　健康與疾病起源(Developmental Origins of Health and Disease，DOHaD)學(xué)說(shuō)在過(guò)去20年得到了極大的發(fā)展。大量流行病學(xué)調(diào)查及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)生命早期不良刺激，尤其是在宮內(nèi)的不良刺激會(huì)引起子代成年后容易出現(xiàn)高血壓、肥胖、胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、哮喘、慢性腎病、甚至腫瘤等成人慢性疾病。
　　中國(guó)心血管病報(bào)告(2013)顯示心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民死亡原因的首位，高

2、血壓是心血管疾病的最主要危險(xiǎn)因素之一，高血壓在人群中發(fā)病率高，但是目前高血壓的發(fā)病機(jī)制還不是很清楚。目前，很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)孕期不良刺激會(huì)引起子代表觀遺傳修飾模式發(fā)生變化，并引起子代產(chǎn)生印記效應(yīng)，并發(fā)生終生性的變化。因此，我們從表觀遺傳學(xué)角度探討孕期不良刺激引起高血壓疾病的發(fā)生機(jī)制，試圖為成年慢性疾病的預(yù)防及治療提供新的思路。在孕期以脂多糖為炎癥刺激刺激因子進(jìn)行刺激發(fā)現(xiàn)孕鼠胎盤(pán)、羊水中的一些細(xì)胞因子(如IL-6、 TNF-α)水平升高

3、。最近研究還發(fā)現(xiàn)高水平的IL-6可以通過(guò)JAK2通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Fli-1水平，并增加DNMT1(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1)的水平;此外，TNF-α也可以使核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)上調(diào)，刺激DNMT3B(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B)表達(dá)增高導(dǎo)致組蛋白甲基化沉默Notch-1基因。這些研究提示炎癥因子可以引起DNMT的表達(dá)水平發(fā)生變化。
　　基于前期實(shí)驗(yàn)并結(jié)合最新研究進(jìn)展，我們提出以下假設(shè):孕期炎癥刺激可能通過(guò)升高子代炎癥因子表達(dá)影響DNA

4、甲基轉(zhuǎn)移酶水平改變導(dǎo)致目的DNA表觀遺傳修飾模式改變，造成了關(guān)鍵基因時(shí)空特異性表達(dá)異常，從而導(dǎo)致慢性成年高血壓病的發(fā)生。
　　本實(shí)驗(yàn)在已建立的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)大鼠腎臟組織中的炎癥因子和甲基化轉(zhuǎn)移酶的水平，探討DNA甲基化是否參與高血壓的發(fā)生機(jī)制。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理
　　16只通過(guò)陰道栓檢查的獲得準(zhǔn)確妊娠時(shí)間的SD大鼠，隨機(jī)分為4組，每組4只。
　　對(duì)照組:在SD大鼠孕期第8-14

5、天每天予以腹腔注射無(wú)菌生理鹽水0.5ml; PDTC組:SD孕鼠在孕期第8-14天每天腹腔注射NF-κB抑制劑PDTC(100mg/kg); LPS組:在孕鼠孕期的第8、10、12天分別予以腹腔注射0.79mg/kg脂多糖(LPS)，在孕期的第9、11、13、14天注射0.5ml生理鹽水;LPS+PDTC組:在孕鼠孕期的第8、10、12天分別予以腹腔注射0.79mg/kg脂多糖(LPS)和PDTC，在孕期的第9、11、13、14天腹腔注

6、射劑量為100mg/kg的PDTC。
　　2.子代大鼠體重及血壓的測(cè)量
　　子代大鼠出生后，4周斷奶分籠，從4周齡到12周齡每2周測(cè)量一次體重，每只稱3次，取平均值。從6周到12周每2周進(jìn)行一次大鼠尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量，每只測(cè)量3次，間隔3分鐘以上，取平均值。
　　3.子代大鼠腎臟組織中IL-6、TNF-α、Fli-1、DNMTs的mRNA水平的測(cè)定
　　采用Real-time PCR方法檢測(cè)子代大鼠腎臟組織的IL

7、-6、TNF-α、Fli-1、DNMTs的mRNA表達(dá)水平。
　　4.子代大鼠腎臟組織中Fli-1、DNMTs蛋白質(zhì)水平測(cè)定
　　用western blot方法檢測(cè)子代大鼠腎臟組織的IL-6、Fli-1、DNMTs蛋白質(zhì)水平。
　　結(jié)果:
　　1.在子代大鼠周齡4-12周時(shí)，每2周檢測(cè)一次體重，子代大鼠LPS組體重高于對(duì)照組，在12周齡時(shí)LPS組明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)，且LPS+PDTC組與對(duì)照組無(wú)明顯差

8、異(p＞0.05)。
　　2.LPS組的子代大鼠血壓明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，而用PDTC進(jìn)行干預(yù)后與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05），說(shuō)明PDTC可以逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)血壓的作用。
　　3.孕期暴露于LPS的子代大鼠腎臟組織中IL-6、Fli-1、DNMT1、DNMT3B的mRNA的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組顯著升高(P＜0.05)，PDTC干預(yù)后可以逆轉(zhuǎn)IL-6、Fli-1、DNMT1、DNMT3B的變化。
　　4.腎臟

9、組織中的TNF-α水平6周齡時(shí)實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組水平增高，但是差異不顯著，而在12周齡時(shí)，LPS組子代大鼠腎臟組織中TNF-α的水平顯著高于對(duì)照組。
　　5.腎臟組織中DNMT3A的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中差異不顯著。
　　結(jié)論:
　　1.孕鼠用脂多糖處理后，出現(xiàn)子代大鼠血壓增高、體重增加，成功復(fù)制了炎癥刺激子代大鼠高血壓的模型;
　　2.用脂多糖對(duì)孕鼠進(jìn)行刺激可以引起子代大鼠腎臟組織DNMT1、DNMT3B表達(dá)增高，