重組體的篩選和鑒定

1、,,,8 重組體的篩選和鑒定,篩選（Screening）遺傳表型（phenotype）：是生物體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。,,本章教學(xué)目的和要求： 掌握常用的抗生素抗性篩選、藍(lán)白斑篩選、酶切篩選、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和免疫印跡（Western blotting）法的原理；了解轉(zhuǎn)譯篩選法和真核生物的報道基因篩選法。重點： 常用的抗菌素抗性篩選、藍(lán)白斑篩選、酶切篩選、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

2、難點： 免疫印跡（Western Blotting）法的原理,,轉(zhuǎn)化子：接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。非轉(zhuǎn)化子：未接納載體或重組分子的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。非重組子：僅含有空載載體分子的轉(zhuǎn)化子。期望重組子：含有目的基因的重組子。非期望重組子：不含有目的基因的重組子。,1 抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法,pBR322質(zhì)粒上有兩個抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位點BamH I

3、和Sal I; Ampr上有插入位點Pst I。,一、利用載體提供的表型特征篩選重組體,原理：,,8.1 遺傳學(xué)檢測法,pBR322,,,,,外源DNA,pBR3224363,,PstI酶切,,PstI酶切,黏性末端,黏性末端,,,,,,連接酶,重組子(ampstetr) 空載體(amprtetr) 插入子(ampstets),,,野生型的E.coli (ampstets),導(dǎo)入,,涂布在含Tc的平板上,重組子轉(zhuǎn)化子(ampst

4、etr) 空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr),,,,影印在含Ap的平板上,空載體轉(zhuǎn)化子(amprtetr),因插入外源DNA而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象稱之為插入失活效應(yīng)。,對比兩個平板上的菌落，凡在Tc平板上生長而在Ap平板上不能生長的菌落則是重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆，挑選陽性克隆，分離出重組質(zhì)粒。,（1）四環(huán)素抗性基因 Tetr ：,（2）氨芐青霉素抗性基因 Ampr ：,pBR322抗菌素標(biāo)記選擇,產(chǎn)生?-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔?/p>

5、使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。,抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。,殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌。,（3）環(huán)絲氨酸：,選擇過程：,如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。,Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。,（1）四環(huán)素抗性插入失活,,無環(huán)絲

6、氨酸培養(yǎng)基,氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程,如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。,,,2.藍(lán)白斑篩選法,?-半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,Xgal,半乳糖,5-溴-4-氯靛藍(lán),,,+,+,深藍(lán)色,原理：,載體上有一段?-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的?片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。 受體菌基因組中有突變的?-半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。 載體和

7、受體菌基因組可以互補形成完整有功能的?-半乳糖苷酶。,假陽性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒有中止密碼；（不破壞?肽）。,選擇過程,β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法,,?-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。,藍(lán)白菌落,,篩選白色菌落,,,,,,,,3.噬菌斑篩選法,噬菌斑(plaque),噬菌斑是指在宿主細(xì)菌的菌苔上，噬菌體使菌體裂解而形成的空斑。,篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞常用的報告基因,報告基因（reporter gene）：系指

8、其編碼產(chǎn)物能夠被快速地測定，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞（器官或組織）并檢測其表達(dá)活性的一類特殊用途的基因。,4.載體提供選擇動植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞常用的標(biāo)記基因,（1）大腸桿菌的β-D-葡萄糖苷酸酶 （β-D-glucuronidase，GUS）； （2）細(xì)菌和螢火蟲的熒光素酶 （luciferase）； （3）水母綠色熒光蛋白（GFP）基因 （Green Fluoresce

9、nt Protein）。,報道基因（reporter gene),（4）其它,幾種報道基因的作用原理,4-甲-β-D-葡萄糖苷酸,熒光產(chǎn)物,,GUS,GFP,,紫外光照,發(fā)綠色熒光,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸,藍(lán)色水解產(chǎn)物,,GUS,,Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP,轉(zhuǎn)入螢火蟲的luciferase的煙草,GFP- Kac的狗,GFP 老鼠,G

10、FP Alba發(fā)青綠光芒的兔子,,①新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（NPTⅡ）抗新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418等抗生素，成為篩選動植物轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記基因。②潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）賦予轉(zhuǎn)化子能抗潮霉素，作為選擇標(biāo)記基因主要用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子。潮霉素是致癌物質(zhì)，操作時應(yīng)慎重。③氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（CAT）也被用于篩選動植物轉(zhuǎn)化子的標(biāo)記基因。,④β-葡萄糖酸酶基因（GUS）,GUS的基因產(chǎn)物β-葡萄糖酸酶（GUS）能夠催化4

11、-甲基傘形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘形花酮，以此篩選含GUS基因的轉(zhuǎn)化子。由于植物細(xì)胞GUS本底非常低，因此廣泛地應(yīng)用于篩選植物轉(zhuǎn)化子。尤其是GUS基因的3’端與其他結(jié)構(gòu)基因連接產(chǎn)生的嵌合基因仍能正常表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在轉(zhuǎn)化生物體中的定位分析。,⑤螢火蟲熒光素酶基因（LUC）,LUC表達(dá)產(chǎn)物螢火蟲熒光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以與熒光素和ATP底物發(fā)生反應(yīng)，形成與酶結(jié)

12、合的腺苷酸熒光素酰化復(fù)合物，經(jīng)過氧化脫羧作用后，該復(fù)合物轉(zhuǎn)變成為處于激活狀態(tài)的氧化熒光素，可以用熒光測定儀快速靈敏地檢測出產(chǎn)生的熒光，是目前研究動植物轉(zhuǎn)基因很好用的一種報告基因。Luc基因檢測十分迅速，靈敏度高，成本低，不存在放射性同位素檢測對人體健康和環(huán)境生態(tài)所造成的危害，也沒有內(nèi)源熒光產(chǎn)生的背景干擾，因此，Luc是一種理想的報告基因。,⑥抗除草劑bar基因,bar基因編碼磷化乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），使轉(zhuǎn)化子對含有磷化麥黃酮（PPT）

13、成分的除草劑具有抗性。,⑦冠癭堿合成酶基因,主要包括胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成基因兩類，存在于土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)段。冠癭堿合成酶基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物可以催化一些特殊反應(yīng)，通過電泳分離及菲醌熒光染料染色，方便地觀察，據(jù)此作為報告基因用于轉(zhuǎn)植物基因細(xì)胞的篩選。冠癭堿合成酶基因在植物基因工程早期應(yīng)用較多，現(xiàn)已逐漸被其他更為理想的報告基因所取代。,在植物轉(zhuǎn)基因研究中采用的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Cat)基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶

14、(NptⅡ)基因也可用于哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選。常用的標(biāo)記基因還有：-- 胸腺核苷激酶基因（TK）-- 二氫葉酸還原酶基因（DHFR）-- 黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（XGPRT）,篩選哺乳動物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞常用的報告基因,真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。,二氫葉酸,四氫葉酸,,二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）,胸苷激酶（thymidine kinase, tk）,（1）T

15、K選擇原理,①四氫葉酸的必要性,DHFR,胸腺核苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）及次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因（hgprt）等的表達(dá)產(chǎn)物直接或間接參與核苷酸合成代謝。這些基因缺失的缺陷型細(xì)胞因核苷酸合成代謝失調(diào)而死亡，只有在添加某些核苷酸的培養(yǎng)基中才能生長。如果用這樣的缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞，導(dǎo)入含有這些基因的外源DNA，補充原來缺失的基因，使核苷酸合成代謝恢復(fù)正常，可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中正常生長。

16、根據(jù)這一性質(zhì)可以在不添加核苷酸的培養(yǎng)基中篩選出轉(zhuǎn)化子。,利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進行直接選擇。（只在特定條件下）。,轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。,一、原理：,二、利用插入序列提供的表型特征篩選,1.彌補缺陷,his-,,his+,受體菌：,外源基因：,,在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長,小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。,DHFR,載體,連接,轉(zhuǎn)化受體菌,三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板,含D

17、HFR的克隆才能生長,,,,,,例：,使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。,2. 增加新性狀,利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。,一、直接電泳檢測法,從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。,8.2 DNA電泳檢測法,,,,,,,,,,分子量 Marker,載體,,重組克隆,二、酶切電泳篩選法-物理檢測法,1. 原理：,根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳

18、結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度）。,或用合適的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果。,,,,A,B,A或B,三、PCR擴增檢測法,1. 原理,PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷。,2. 過程,（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）,（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR,（3）電泳PCR產(chǎn)物,（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物,（5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致,1. 核酸雜交,8.3 核酸分子雜交檢

19、測,一、原理：,重組克隆與探針雜交,3. 識別標(biāo)記,32P 或 125I 。,（1）放射性同位素,2. 檢測用的探針,與外源DNA插入片斷互補的序列,（2）非放射性標(biāo)記,熒光素、生物素地高辛,二、核酸雜交檢測方法,,用DNA （或RNA）探針檢測DNA樣品。,1. Southern blotting,從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。,只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。,SouthernBl

20、otting,,,,,,,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,瓊脂糖電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,與放射性標(biāo)記DNA探針雜交,放射自顯影,帶有DNA片段的凝膠,凝膠,濾膜,,,,,,用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA,吸附有DNA片段的膜,,,Southern blot,,,,,,,,,,,,,,,探針,,,（1）原位雜交篩選,特點：,對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。,原位雜交篩選DNA重組體圖解,,,復(fù)印至硝酸纖維素膜上,用NaOH菌

21、體裂解DNA變性,,,,雜交,放射自顯影,32P-cDNA,,與放射性cDNA雜交的菌落的斑點,細(xì)菌菌落,單鏈DNA結(jié)合到膜上,,,,（2）R-環(huán)檢測法,DNA-RNA雜交,1）原理：,2）選擇過程,在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見一種R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。,用外源基因的mRNA與重組載體雜交。,,缺點：需要電鏡！,2. Northern blotting,用DNA（或

22、RNA）探針檢測RNA樣品。,主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。,從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。,Northern Blotting,,Western Blotting,,Southern和Western印跡法,,DNA frangment,Electrophoresis,Transfer of DNA by blotting,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,32P-labled DNA probe,,Autor

23、adiography,Agarrose gel,Autoradiogram,Nitrocellulose sheet,,,,,,,,Autoradiogram,Polymer sheet,,,SDS-Polyacrylamide gel,,,,,,,,,,,,,Transfer protein,,Add radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibody,Prot

24、ein band detected by specific antibody,,Autoradiography,利用抗體作為“探針”來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。,根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：,一、放射免疫測定法,8.4 免疫化學(xué)類檢測法,1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式,對表達(dá)產(chǎn)物的檢測。蛋白—蛋白“雜交”,,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,125I 標(biāo)記的二 抗結(jié)合蛋白,固相支

25、持濾膜,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,125I標(biāo)記的二抗,固相支持濾膜,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,固相支持濾膜,固相支持濾膜,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,125I 標(biāo)記的二抗 結(jié)合蛋白,125I標(biāo)記的二抗,2. 放射免疫測定法過程,細(xì)菌菌落溶解，釋放出抗原蛋白質(zhì),,,,免疫化學(xué)法檢測克隆在載體pUC8上的小雞原肌球蛋白基因,濾膜,,,,,,,抗體溶液,放射性標(biāo)記抗體檢測法的操作程序,聚乙烯薄膜,,,,培養(yǎng)皿及菌落,,,,放射性標(biāo)

26、記抗體檢測法的操作程序,3. Broome-Gilbert雙定位檢測法,質(zhì)?；駻,,插入基因B,,表達(dá),質(zhì)粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,,檢測融合蛋白,既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物,,固相支 持濾膜,抗A抗體,125I標(biāo)記的 抗B抗體,質(zhì)粒蛋白A,外源蛋白B,質(zhì)粒蛋白A,外源蛋白B,,固相支 持濾膜,抗A抗體,,發(fā)光，底片曝光,二、免疫沉淀檢測法,把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍

27、時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”(白色圓圈)。,1. 原理,抗原—抗體凝集反應(yīng)。,檢測分泌型產(chǎn)物。,2. 方法,,對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。,三、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）,Enzyme-linked immunosorbant assay,1. 原理：,一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 二抗（secondary antibod

28、y）： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標(biāo)分子的含量。,,,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,酶,待測基因 產(chǎn)物蛋白,一抗,二抗,,,,,無色的底物,有色的產(chǎn)物,,,,比色觀察,酶,19,2. ELISA檢測的一般步驟,（1）固定樣品,將待測樣品加入9

29、6孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。,孔底,加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。,（2）一抗結(jié)合,一抗,,,,加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。,二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。,（3）二抗結(jié)合,二抗,,,,加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。,（4）顯色反應(yīng),,在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。,（5

30、）比色,3.ELISA的局限性,有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。 必須與其他方法一起綜合考慮。,無細(xì)胞翻譯系統(tǒng),8.5 轉(zhuǎn)譯篩選法,能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。 如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。,借助無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。,要求：被研究的目的基因編碼有豐富的mRNA 。,原理：,步驟：,轉(zhuǎn)化菌落,提取重組DNA,與mRNA總

31、雜交,形成DNA-RNA雜種分子,將總mRNA（包括DNA-RNA分子,,,,,提取出來,,體外轉(zhuǎn)譯,蛋白電泳放射自顯影 （1）,,總mRNA,,體外轉(zhuǎn)譯,蛋白電泳放射自顯影 （2）,,經(jīng)對比，（1）比（2）中少了一種蛋白質(zhì),,找到一種轉(zhuǎn)譯作用被抑制了的mRNA,篩選出重組菌落（或噬菌斑）,,1. 雜交抑制的轉(zhuǎn)譯,敏感；適于研究目的基因編碼低豐度的mRNA,重組體庫,,提取DNA,固定在NC膜上,,,與mRNA或總RNA雜交,目