中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療,石奕武神經(jīng)科學(xué)研究所廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,概 述,定義早期是指用正常的基因整合入細(xì)胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。,目前廣義上來(lái)講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。,基因治療的概念,基本程序,治療性基因的選擇,基因載體的選擇,回輸體內(nèi),,重組表達(dá)載體,應(yīng)用與展望,1）單基因缺陷病2）體細(xì)胞的基因治療3）靶細(xì)胞可以從病人機(jī)體獲

2、取4）治療效果勝過(guò)危害5）表達(dá)水平無(wú)需嚴(yán)格調(diào)控6）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明符合嚴(yán)格的安全標(biāo)準(zhǔn),研究概況1990年，美國(guó)批準(zhǔn)了人類第一個(gè)對(duì)遺傳病進(jìn)行體細(xì)胞基因治療的方案，即將腺苷脫氨酶（ADA）導(dǎo)入一個(gè)4歲患有嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷綜合征（SCID）的女孩。采用的是反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的間接法，即用含有正常人腺苷脫氨酶基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體培養(yǎng)患兒的白細(xì)胞，并用白細(xì)胞介素Ⅱ（IL－2）刺激其增殖，經(jīng)10天左右再經(jīng)靜脈輸入患兒。大約1－2月治療一次

3、，8個(gè)月后，患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)到正常值的25％，未見明顯副作用。此后又進(jìn)行第2例治療獲得類似的效果。致使世界各國(guó)都掀起了基因治療的研究熱潮。,經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，基因治療已取得初步的臨床療效，例如2000年法國(guó)巴黎內(nèi)克爾兒童醫(yī)院利用基因治療使11名有免疫缺陷的嬰兒恢復(fù)了正常的免疫功能,盡管后來(lái)有一名兒童患了白血病,但這仍是近十年來(lái)基因治療取得的最大成功。目前每年用于基因治療上的總投資在10億美元左右，主要集中在美國(guó)，其次是歐

4、洲。到2001年底全世界已批準(zhǔn)了600個(gè)基因治療臨床試驗(yàn)方案，其中針對(duì)癌癥治療的方案居首位，有378個(gè)方案，占總數(shù)的63.1%；其次是針對(duì)單基因疾病、心血管病、傳染性疾病（主要是HIV）、基因標(biāo)記和其他疾病治療方案。,神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治--人們面臨的巨大挑戰(zhàn)大多數(shù)炎癥、營(yíng)養(yǎng)缺乏性疾病及良性腫瘤等，通過(guò)傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)和飲食療法可以治愈相當(dāng)多的疾患不能治愈--帕金森病、亨廷頓病等有一些疾病至今仍無(wú)防治方法，如阿爾茨海默病

5、及惡性腫瘤等全新的治療概念──中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的基因治療(gene therapy),一、中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療概述,存在著一定的困難:①CNS被嚴(yán)密的骨質(zhì)系統(tǒng)所包裹,使得一些重要的物理操作相對(duì)難以進(jìn)行；②完整的血腦屏障(BBB)的存在是向腦內(nèi)導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)移載體的天然屏障；,③神經(jīng)系統(tǒng)功能的分子機(jī)制及其疾病的分子遺傳學(xué)變化最近才緩慢地得到了初步的認(rèn)識(shí),因此,能夠通過(guò)基因修飾而得到治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病較少;④對(duì)于某些CN

6、S代謝性疾病(如溶酶體蓄積病),在出生之前就已經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)有大量毒性物質(zhì)的堆積,提示必需在胚胎期就進(jìn)行治療才有可能取得滿意的療效;,⑤神經(jīng)系統(tǒng)由多種功能不同并且高度分化的細(xì)胞組成,細(xì)胞之間存在著不同的、復(fù)雜的甚至是變化著的聯(lián)系,不同的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞之間在結(jié)構(gòu)上和功能上可能存在著相當(dāng)大的差異,因此,神經(jīng)系統(tǒng)遠(yuǎn)比其它器官都要復(fù)雜;,⑥神經(jīng)細(xì)胞或膠質(zhì)細(xì)胞均很難大量分離以用于原代培養(yǎng)和遺傳修飾。對(duì)成熟神經(jīng)元和/或膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳

7、修飾并有效地進(jìn)行腦內(nèi)移植的技術(shù)方法還未完全成熟。,隨著近年來(lái)基因治療的技術(shù)方法上的進(jìn)展, 初步結(jié)果顯示基因治療在CNS疾病的治療中也具有廣闊的應(yīng)用前景。其原因在于:①隨著定位克隆和疾病相關(guān)基因的分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的遺傳學(xué)病因得到了澄清;,②隨著對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制了解的深入,目前已經(jīng)確認(rèn)的基因治療方法不僅適用于有明確基因改變的遺傳性疾病,而且也適用于非遺傳性疾病的治療;,③ 可以使用非神經(jīng)

8、細(xì)胞或非膠質(zhì)細(xì)胞(如自體成纖維細(xì)胞或成肌細(xì)胞)作為遺傳修飾細(xì)胞; ④ 最近發(fā)現(xiàn)有些藥物可造成BBB的一過(guò)性滲透性損傷,從而使大分子物質(zhì)甚至基因轉(zhuǎn)移載體進(jìn)入腦內(nèi);,⑤已成功地構(gòu)建了一些新型的、能夠感染非分裂期終分化細(xì)胞(如神經(jīng)元)的病毒基因轉(zhuǎn)移載體(如復(fù)制缺陷型重組腺病毒、皰疹病毒及腺病毒相關(guān)病毒等),從而使向成熟神經(jīng)元和/或膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)直接進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移成為可能。,（一）中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的分類,根據(jù)靶細(xì)胞分類生殖細(xì)胞

9、(germ cell)基因治療:將受精卵或早期胚胎細(xì)胞做為治療目標(biāo)進(jìn)行生殖細(xì)胞的基因治療是可行的；受精卵或早期胚胎細(xì)胞的遺傳改變勢(shì)必影響后代，倫理學(xué)障礙和技術(shù)上的困難使生殖細(xì)胞基因治療目前仍為禁區(qū)。,體細(xì)胞(somatic cell)基因治療：體細(xì)胞基因治療只涉及體細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)變，不影響下一代，現(xiàn)已被廣泛接受做為CNS嚴(yán)重疾病的治療方法之一，在現(xiàn)代倫理道德上是可行的。方法上易于施行，而且已取得了可喜的成果。,根據(jù)基因轉(zhuǎn)移

10、的途徑in vivo (活體直接轉(zhuǎn)移，或稱一步法)：指將含外源基因的重組病毒、脂質(zhì)體或裸露的DNA直接導(dǎo)入CNS內(nèi)；操作簡(jiǎn)便、容易推廣。尚不成熟，存在療效短、免疫排斥及安全性等問(wèn)題基因轉(zhuǎn)移研究的方向，只有in vivo基因轉(zhuǎn)移方法成熟了，基因治療才能真正走向臨床。,指外源基因克隆至一個(gè)合適的載體，首先導(dǎo)入體外培養(yǎng)的自體或異體(有特定條件)的細(xì)胞，經(jīng)篩選后將能表達(dá)外源基因的受體細(xì)胞重新輸回受試者CNS內(nèi), 實(shí)質(zhì)上就是遺

11、傳修飾細(xì)胞的腦移植。經(jīng)典、安全、而且效果較易控制，但是步驟多、技術(shù)復(fù)雜、難度大、不容易推廣。,ex vivo(離體轉(zhuǎn)移或稱二步法),（二）中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的策略根據(jù)宿主CNS病變的不同，CNS基因治療的策略也不同，概括起來(lái)主要有下列四種：1、基因替代(gene replacement) 指去除整個(gè)變異基因，用有功能的正?；蛉《怪虏』虻玫接谰玫母?。優(yōu)點(diǎn)：遺傳性疾病等的最理想的方法缺點(diǎn)：難以實(shí)現(xiàn),2

12、、基因修正(gene correction) 將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。如基因打靶技術(shù)(同源基因重組)的研究進(jìn)展已表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組確實(shí)存在著某些結(jié)構(gòu)和酶學(xué)機(jī)制，可使外源DNA在特定的部位進(jìn)行重組，從而使缺陷基因在原位特異性修復(fù)成為可能。,3、基因增強(qiáng)(gene augmentation) 將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物可以補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能或使原有的功能得到加強(qiáng)。近十

13、年來(lái)已經(jīng)發(fā)展了許多有效的方法可將目的基因?qū)胝婧思?xì)胞，并獲得表達(dá)，因而是目前較為成熟的方法。最適宜隱性單基因疾病的治療,4、基因抑制(gene constraint)和/或基因失活(gene inactivation) 導(dǎo)入外源基因去干擾、抑制有害的基因表達(dá)。如向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入腫瘤抑制基因(如Rb或p53)，以抑制癌基因的表達(dá)。,此外利用反義技術(shù)(antisense technology)封閉某些特定基因的表達(dá)，以達(dá)到抑制有害

14、基因表達(dá)的目的，已被廣泛用于CNS惡性腫瘤(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)等的基因治療研究中。,（三）中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因治療的原則必須分離出含有調(diào)節(jié)序列的特異性基因；必須能夠獲得足夠數(shù)量攜帶該基因的載體或/和細(xì)胞；,必須建立一條有效的途徑將該外源基因?qū)肽X內(nèi)、轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞；最后轉(zhuǎn)染入宿主腦細(xì)胞的目的基因必須能產(chǎn)生足夠量的產(chǎn)物，可維持適當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，且不產(chǎn)生有害的副作用。導(dǎo)入CNS內(nèi)的基因要特異、穩(wěn)定、高效、安全并具有可調(diào)控性。,1、目

15、的基因的選擇 ①該基因的異常是疾病發(fā)生的根源；②該基因遺傳的分子機(jī)制清楚；③基因已被克隆，一級(jí)結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控機(jī)制較為清楚；,④可在體外操作，而且安全有效；⑤轉(zhuǎn)移基因在受體細(xì)胞內(nèi)最好能夠完整地、穩(wěn)定地整合并能適時(shí)適量表達(dá)功能性蛋白質(zhì)。,染色體基因組互補(bǔ)DNA (complementary DNA，cDNA)多數(shù)是通過(guò)cDNA的克隆化技術(shù)得到的?？蓱?yīng)用人工合成、PCR技術(shù)擴(kuò)增等途徑獲得目的基因,2、目的基因來(lái)源：,

16、目的基因必須置于合適的啟動(dòng)子的控制之下，編碼基因的信號(hào)肽序列(signal sequence)必須完整，只有這樣，目的基因才可獲得適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，基因調(diào)控是目前基因治療研究的薄弱環(huán)節(jié)。,其原則為：①最好選擇組織特異性細(xì)胞，即外源基因僅在該系統(tǒng)組織中表達(dá)，而在其它組織中不表達(dá)或表達(dá)水平較低；②細(xì)胞要易于從體內(nèi)取出，有增殖趨勢(shì)，且生命周期較長(zhǎng)，使得有足夠的時(shí)間進(jìn)行體外基因操作；,3、 受體細(xì)胞的選擇 --成敗的一個(gè)關(guān)鍵因素，

17、選擇病變發(fā)生細(xì)胞/非病變發(fā)生細(xì)胞,③離體的細(xì)胞要能接受外源基因的轉(zhuǎn)染；④細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外基因操作后能夠存活下來(lái)，并能安全輸送回體內(nèi)；⑤能預(yù)設(shè)某一安全機(jī)制，在必要時(shí)可激活以阻止修飾細(xì)胞在體內(nèi)有害的生長(zhǎng)和/或有害功能的發(fā)揮，以避免腫瘤發(fā)生。,目前，應(yīng)用于CNS基因治療研究的靶細(xì)胞主要有成纖維細(xì)胞、原代骨骼肌細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎中腦細(xì)胞、條件永生性神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞。適合于基因轉(zhuǎn)染及腦內(nèi)移植的靶細(xì)胞最好來(lái)自宿主自身的同源細(xì)胞，以避免

18、發(fā)生免疫排斥。,膠質(zhì)細(xì)胞優(yōu)勢(shì)是能很好地在體外生長(zhǎng)與繁殖，移植到腦內(nèi)靶點(diǎn)后可很好地存活并整合到腦實(shí)質(zhì)中，可獲得長(zhǎng)期、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，是一種潛在的基因治療細(xì)胞載體；其缺陷是植入腦內(nèi)成瘤的危害性大。,胚胎中腦細(xì)胞相對(duì)安全，但細(xì)胞難于獲得，在體外培養(yǎng)較難，且不易用經(jīng)典方法行基因轉(zhuǎn)染。神經(jīng)干細(xì)胞最理想的轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞，因它們?cè)谏L(zhǎng)因子作用下能夠不斷生長(zhǎng)繁殖，且植入腦后也能根據(jù)所處環(huán)境分化成相應(yīng)細(xì)胞，并與宿主形成突觸聯(lián)系。,4、基因載體的

19、選擇 目的基因本身一般不含有啟動(dòng)子等調(diào)控序列，導(dǎo)入靶細(xì)胞后很難得到目的基因的表達(dá)。因此，必須將目的基因重組于表達(dá)載體的合適位置，再導(dǎo)入細(xì)胞，在特定調(diào)控序列指導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)載體有質(zhì)粒載體(plasmid vector)和病毒載體(viral vector)兩大類。,質(zhì)粒載體一般可用物理的、化學(xué)的以及融合法導(dǎo)入靶細(xì)胞。包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控元件，細(xì)菌胞漿內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的表達(dá)元件，因此被稱為穿梭載體(shuttle vec

20、tor)，意指在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和原核生物細(xì)胞中均能穩(wěn)定復(fù)制、穩(wěn)定存在的基因載體。,目前被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)粒載體有pSV2，pRSV，pcDNA3和pCI載體系列等。可插入較大長(zhǎng)度的外源基因(～10kb以上)，有較廣泛的宿主細(xì)胞范圍，經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不發(fā)生裂解，故可建立穩(wěn)定分泌外源蛋白的細(xì)胞株，用于ex vivo基因轉(zhuǎn)移。,病毒載體的構(gòu)建原則與質(zhì)粒載體相似，但進(jìn)入靶細(xì)胞的方式不同。目的基因與病毒載體重組形成重組載體。在

21、基因治療中多是將此重組載體以不同方式進(jìn)行包裝，獲得重組的病毒顆粒，再感染靶細(xì)胞，以便將目的基因帶入靶細(xì)胞，并得到目的基因的表達(dá)。有多種病毒載體，其特點(diǎn)各異。,病毒載體,（四）中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移的方法和實(shí)施途徑CNS基因轉(zhuǎn)移方法分為物理、化學(xué)和生物學(xué)三大類。前兩類是非病毒的方法，后一類即生物學(xué)方法主要指病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，包括ＲＮＡ病毒，ＤＮＡ病毒兩類。,1、病毒載體介導(dǎo)途徑 即以復(fù)制缺陷的重組病毒將靶基因引入體內(nèi)。

22、許多病毒載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒及多種雜交型病毒載體等，已應(yīng)用于CNS基因治療的基礎(chǔ)和臨床研究。作為基因治療的載體，要得到廣泛應(yīng)用，必須簡(jiǎn)單、安全、可靠，且能在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。,迄今為止，病毒載體用于CNS細(xì)胞基因傳遞取得了許多進(jìn)展，盡管其安全性及效率仍有待提高，但in vivo方法已成為目前CNS基因轉(zhuǎn)移的主要研究方向，只有in vivo方法取得成功，CNS基因治療才能走向

23、臨床。,重組病毒載體因其自然感染途徑而成為較有效的基因轉(zhuǎn)移手段，病毒載體用于腦內(nèi)基因傳遞應(yīng)具備哪些特點(diǎn)呢？1、插入基因的容量必須足夠因載體內(nèi)包含了目的基因、特異性調(diào)控序列及可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；,病毒載體的特點(diǎn),2、腦內(nèi)基因注射存在容量限制問(wèn)題，故向特定神經(jīng)元細(xì)胞群轉(zhuǎn)染目的基因時(shí)，載體的轉(zhuǎn)染效率及滴度必須較高3、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定表達(dá)是必要的，由于啟動(dòng)子的失活，載體序列的物理喪失，細(xì)胞毒性效應(yīng)及外源蛋白的免疫反應(yīng)，此目標(biāo)常常較

24、難實(shí)現(xiàn)。,4、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物表達(dá)量的可調(diào)控性也是重要的，載體中包含的特異性調(diào)控序列對(duì)治療控制是必要的。病毒載體具有CNS細(xì)胞特異性的靶向性，即病毒載體能通過(guò)細(xì)胞特異性啟動(dòng)子、特殊的受體表達(dá)或軸漿運(yùn)輸路線，選擇性地感染某些細(xì)胞。病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移能應(yīng)用于臨床，無(wú)毒性或炎癥性免疫反應(yīng)是必要的。,2、非病毒介導(dǎo)途徑即通過(guò)物理法、化學(xué)法或融合法直接將目的基因?qū)塍w內(nèi)。避免重組病毒包裝過(guò)程中產(chǎn)生的野生病毒污染和免疫反應(yīng)，具有

25、安全、操作簡(jiǎn)單、插入容量不受限制及可通過(guò)物理方法實(shí)現(xiàn)靶向性轉(zhuǎn)移（如基因槍）等優(yōu)點(diǎn)。,直接導(dǎo)入的DNA通常難以整合入基因組，基因表達(dá)存在不穩(wěn)定性，且在非分裂細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)染效率不高，使其應(yīng)用受到限制。,迄今為止，在基因治療研究中所用的非病毒基因轉(zhuǎn)移法有ＤＮＡ直接注射法，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、顆粒轟擊技術(shù)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的ＤＮＡ轉(zhuǎn)移法，受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法等。,這些基因轉(zhuǎn)移方法可以轉(zhuǎn)移僅由ＤＮＡ組成的載體，并依賴不同機(jī)制將大

26、分子物質(zhì)攝入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸。由此等方法轉(zhuǎn)移的外源基因的表達(dá)是暫時(shí)的，因?yàn)檫@些基因不易穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞的基因組，而易被細(xì)胞內(nèi)的ＤＮＡ酶降解，并將其排出胞外。,從概念上說(shuō)，非病毒基因轉(zhuǎn)移要比病毒基因轉(zhuǎn)移方法安全。應(yīng)用這些方法的前提是重組基因在人組織中只需要暫時(shí)性表達(dá)，這在某些疾病如腦腫瘤的治療中是很有用的，同時(shí)這些基因可以象藥物一樣被反復(fù)應(yīng)用。,二、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的實(shí)驗(yàn)研究,許多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型已應(yīng)

27、用于CNS疾病基因治療研究，包括神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病、神經(jīng)變性疾病、腦缺血、腦創(chuàng)傷及腦腫瘤等。這些模型均可通過(guò)藥物誘導(dǎo)或損傷誘發(fā)，而腦腫瘤模型則可通過(guò)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞移植動(dòng)物腦內(nèi)而產(chǎn)生。,隨著許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病致病基因的明確，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠復(fù)制具有人類疾病相同遺傳病因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型已成為現(xiàn)實(shí)，這些小鼠模型包括嗜質(zhì)體酶缺乏癥、視網(wǎng)膜變性綜合征，此外還包括自發(fā)性腦腫瘤和神經(jīng)變性綜合征等。,（一）遺傳性神經(jīng)疾病 人類基因

28、治療最早著眼于遺傳性疾?。ㄖ饕抻趩位蜻z傳病），隨著越來(lái)越多CNS遺傳病致病基因的發(fā)現(xiàn)和克隆，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠復(fù)制具有人類疾病相同遺傳病因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型也已成為現(xiàn)實(shí)，使得遺傳性疾病的基因治療研究變得更加活躍。,1、Huntington病 一種以基底節(jié)和大腦皮層變性為主要病變的常染色體顯性遺傳病，主要臨床特征是慢性進(jìn)行性發(fā)展的舞蹈樣動(dòng)作和癡呆。其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，目前，研究發(fā)現(xiàn)HD與IT15基因的單一型突變有關(guān)，導(dǎo)致

29、Huntington蛋白中的多聚谷胺酰胺纖維大量增加，使紋狀體GABA能輸出神經(jīng)元細(xì)胞群對(duì)興奮性毒性、氧化應(yīng)急和線粒體功能障礙的敏感性增加。,幾種HD基因治療方法已分別在DNA、RNA和蛋白水平進(jìn)行了研究，反義基因治療對(duì)這種疾病來(lái)說(shuō)還存在技術(shù)上困難，但保護(hù)性基因治療方法卻取得了令人鼓舞的結(jié)果。后者主要包括移植能分泌保護(hù)或替代因子的工程細(xì)胞，例如產(chǎn)生NGF的成纖維細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞。,幾種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，包括BDNF，已被證

30、實(shí)有益于紋狀體神經(jīng)元的存活。Bemelmans等將克隆BDNF基因的Ad注射至Huntington 病模型大鼠的紋狀體中，發(fā)現(xiàn)BDNF的存在能促進(jìn)紋狀體神經(jīng)元的存活。,2、杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良征,（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是男性中最常見的X連鎖致死性遺傳病，其特點(diǎn)是包括呼吸肌在內(nèi)的全身骨骼肌進(jìn)行性萎縮?，F(xiàn)已證實(shí)dystrophin基因（dystrophin gene）的突變或缺失是導(dǎo)致DMD的主

31、要原因。,目前，dystrophin基因已被克隆，dystrophin全長(zhǎng)cDNA約為14kb。應(yīng)用dystrophin基因治療DMD的研究正在進(jìn)行，Akkaraju等應(yīng)用第一和第二代復(fù)制缺陷型HSV載體，介導(dǎo)全長(zhǎng)dystrophin基因轉(zhuǎn)移至dystrophin缺陷的肌萎縮細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，并觀察到dystrophin在肌萎縮細(xì)胞中和小鼠體內(nèi)的表達(dá)，但治療范圍局限于注射部位，因不能得到全身性的治療效果，其應(yīng)用前景并不樂

32、觀。,Cho等就此問(wèn)題進(jìn)一步進(jìn)行了探索，他們?cè)趹?yīng)用重組Ad介導(dǎo)dystrophin基因轉(zhuǎn)移取得成功的基礎(chǔ)上，通過(guò)改變血管腔內(nèi)的Starling力和肌纖維成熟度，試圖從血管內(nèi)途徑給予克隆dystrophin基因的Ad，從而達(dá)到全身治療目的。,3、神經(jīng)退變性疾病：如帕金森病目前有兩種主要策略：①神經(jīng)遞質(zhì)合成或代謝酶的基因轉(zhuǎn)移，可部分增強(qiáng)變性系統(tǒng)的功能。②營(yíng)養(yǎng)因子或保護(hù)蛋白的轉(zhuǎn)基因可以延緩或阻止進(jìn)一步的神經(jīng)變性進(jìn)程。,①、

33、帕金森?。≒arkinson’s disease，PD ） 中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，主要病理特征為黑質(zhì)紋狀體系多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡，多巴胺(dopamine, DA)含量顯著減少。臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、動(dòng)作減少及平衡障礙。由于其病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前的所有治療手段，包括藥物治療和各種外科手術(shù)只限于癥狀控制，不能從根本延緩或阻止其病程的進(jìn)展。,70年代后期國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾嘗試應(yīng)用腎上腺髓質(zhì)細(xì)

34、胞、胚胎黑質(zhì)細(xì)胞、交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及復(fù)合組織細(xì)胞移植治療PD。取得了一些進(jìn)展，但由于供體細(xì)胞來(lái)源困難、免疫排斥、植入細(xì)胞難以在宿主腦內(nèi)長(zhǎng)期存活等諸多因素，限制了它的臨床應(yīng)用。,目前對(duì)PD治療研究最多、最有前途的方法為基因治療。PD被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的最佳模型，因?yàn)樗牟±頇C(jī)制較明確，病變部位局限，變性細(xì)胞單一，相關(guān)的基因已被克隆，有適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，移植的方法也比較成熟。,PD基因治療主要有兩條途徑：通過(guò)引入左

35、旋多巴或多巴胺合成酶，提高紋狀體內(nèi)多巴胺含量；通過(guò)引入潛在的神經(jīng)保護(hù)分子，阻止多巴胺神經(jīng)元進(jìn)一步死亡，促進(jìn)受損的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)重建和功能恢復(fù)。提高腦內(nèi)多巴胺含量能減輕其臨床癥狀，而阻止多巴胺能神經(jīng)元死亡，則有可能從根本上治愈該病。,體內(nèi)多巴胺合成過(guò)程中存在兩種催化酶，酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和芳香氨基酸脫羧酶（aromatic-amino-acid decarboxylase, A

36、ADC），TH是腦內(nèi)多巴胺生物合成的限速酶，PD患者TH及TH mRNA的水平明顯低于正常人，而TH mRNA/TH的比值與正常人沒有明顯差異，提示通過(guò)腦內(nèi)補(bǔ)充TH基因，可以促進(jìn)L-Dopa的生成。,而AADC即使在紋狀體失神經(jīng)支配情況下，在非多巴胺神經(jīng)能神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞中仍充分存在。故治療中只需在紋狀體內(nèi)表達(dá)外源性TH，多巴胺含量即可明顯提高。但TH的活性功能離不開輔助因子BH4的作用，在紋狀體失神經(jīng)支配時(shí)這種輔助因

37、子的水平也下降，TH和BH4合成酶，GTP-cyclohydrolase1的聯(lián)合移植，對(duì)獲得足夠的L-dopa產(chǎn)物是需要的。,Wolff 等應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將TH cDNA 轉(zhuǎn)染至大鼠的尾狀核，獲得了TH的表達(dá)，并使模型動(dòng)物阿撲嗎啡誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)明顯減少。Jiao等將含有TH的表達(dá)質(zhì)粒(pCMVth)在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染肌母細(xì)胞和肌管細(xì)胞(myotube),聯(lián)合移植于PD大鼠紋狀體內(nèi)， 獲得高水平的穩(wěn)定表達(dá)(6個(gè)月以上)，

38、使阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少了75%。,Anton等將含有TH表達(dá)載體的溫度敏感性永生性大鼠神經(jīng)細(xì)胞( 衍生于體外培養(yǎng)的原始中腦胚胎細(xì)胞)THB2和LP6細(xì)胞混合移植入2只PD猴模型紋狀體內(nèi)，結(jié)果猴的旋轉(zhuǎn)行為減少了54%，免疫組化確證了TH的存在。,通過(guò)對(duì)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)使黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)得以保存是PD治療最佳目標(biāo)，既可以延緩PD進(jìn)程，又可避免L-dopa治療引起的副作用。研究表明應(yīng)用in vivo或 ex vivo

39、方法將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、抗凋亡分子及抗氧化劑等基因分別轉(zhuǎn)染黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)后，均能達(dá)到神經(jīng)保護(hù)治療目的。,膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）是目前發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)多巴胺能神經(jīng)元具有很高的特異性營(yíng)養(yǎng)活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，研究表明外源性的GDNF在黑質(zhì)、紋狀體內(nèi)的表達(dá)可以對(duì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生十分明顯的營(yíng)養(yǎng)作用。,GDNF基因的有效表達(dá)，可以減緩、阻

40、止甚至逆轉(zhuǎn)多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變過(guò)程，從而從根本上遏制PD的漸進(jìn)性病程。Derek等將編碼GDNF的一種復(fù)制缺陷腺病毒載體直接注射到帕金森病大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)，證實(shí)DA神經(jīng)元能免受6-OHDA的損害,近年來(lái)細(xì)胞凋亡在PD發(fā)病機(jī)制中的作用已被認(rèn)識(shí)，自由基、某些神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)毒素及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏等因素啟動(dòng)了這一機(jī)制，通過(guò)細(xì)胞自身內(nèi)部基因調(diào)控過(guò)程，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺(DA)能神經(jīng)元發(fā)生凋亡。,在此認(rèn)識(shí)上，采用各種抗細(xì)胞

41、凋亡治療措施可保護(hù)DA神經(jīng)元，NTFs已被證實(shí)能保護(hù)神經(jīng)元免受凋亡。Clarkson等證實(shí)用GDNF在體外培養(yǎng)胚胎大鼠中腦DA神經(jīng)元，其凋亡發(fā)生率可降低2%～5%。原癌基因bcl-2其多方位的抗凋亡作用機(jī)制已較為明確，將其基因克隆后轉(zhuǎn)染黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)表達(dá)，則可保護(hù)DA神經(jīng)元免受凋亡。,Mattew(1996)等將攜帶bcl-2基因的缺陷型單純皰疹病毒(HSV)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元后，證實(shí)的bcl-2過(guò)度表達(dá)能保護(hù)

42、神經(jīng)元免受阿霉素毒性損害，并觀察到其在體內(nèi)表達(dá)時(shí)能保護(hù)紋狀體神經(jīng)元免受局部缺血的損害。,AD基因治療的早期策略是向腦內(nèi)移植遺傳修飾后的能產(chǎn)生NGF的自體同源細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞。除了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子外，還可以通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)的恢復(fù)和替代方法治療AD，膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（choline acetylase,ChA）是腦內(nèi)乙酰膽堿合成的限速酶，AD患者腦內(nèi)存在ChA活性下降,乙酰膽堿合成減少。,②、阿爾茨海默病 (Alzheimer‘s

43、Disease ，AD),轉(zhuǎn)導(dǎo)ChA基因，提高乙酰膽堿合成，可治療AD。最近，Saille等研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)人類抗凋亡基因bcl-2的轉(zhuǎn)基因小鼠皮層神經(jīng)元，可明顯抵抗β-淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性損害，提示以抑制神經(jīng)元凋亡為目的的AD神經(jīng)保護(hù)基因治療具有研究潛力。,是一種發(fā)生于成年人的致命性神經(jīng)變性疾病，以進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性為特征。其病因目前還不明確，亦無(wú)有效治療方法?，F(xiàn)已證實(shí)編碼超氧化物歧化酶（superoxide dismu

44、tase，SOD）的基因突變與家族性ALS發(fā)病有關(guān)。研究表明各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如CNTF、GDNF、BDNF、IGF-1等可不同程度保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。,4、肌萎縮性側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis ，ALS）,臨床研究發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子全身給藥后，不易通過(guò)血腦屏障，甚至出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)（如CNTF），為了安全向ALS病人體內(nèi)引入這些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，基因治療已成為一種主要研究手段。,目前，幾

45、種ALS基因治療方法正在探索：Aebischer等將球囊包裹可分泌CNTF的工程細(xì)胞移植到ALS患者腰部鞘內(nèi)，盡管未取得明顯的治療效果，但可從CSF中檢測(cè)到CNTF的水平，且未發(fā)現(xiàn)明顯毒性作用。,Haase等通過(guò)肌肉和靜脈內(nèi)注射Ad介導(dǎo)的CNTF到進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病突變小鼠，可延長(zhǎng)其生存期和降低神經(jīng)元變性，而腦脊液內(nèi)給藥被證實(shí)無(wú)效。ΒDNF或GDNF可保護(hù)新生鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元免受軸突切斷引起的變性損害。,Mohajeri等將

46、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的GDNF的成肌細(xì)胞，注射至6周齡家族性ALS轉(zhuǎn)基因小鼠后肢肌肉中，18周齡時(shí)接受GDNF成肌細(xì)胞小鼠較對(duì)照組體內(nèi)存在較高數(shù)目的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。表明產(chǎn)生GDNF的成肌細(xì)胞可減慢疾病進(jìn)展或延緩這種小鼠運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)病變的進(jìn)展。,最近，Azzouz等將rAAV介導(dǎo)的抗凋亡基因bcl-2注射至SOD突變轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓內(nèi)，證實(shí)能觀察到bcl-2蛋白在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)，并能顯著增加疾病晚期運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)目。,5、腦腫瘤

47、治療CNS腫瘤細(xì)胞分型較復(fù)雜，主要包括星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦膜瘤和垂體瘤等，其中前兩者約占50%。盡管依據(jù)現(xiàn)有診療水平CNS惡性腫瘤不難得到確診，但由于其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)特性及腫瘤細(xì)胞基因的異質(zhì)性，血液中藥物進(jìn)入腦內(nèi)困難和CNS較差的免疫監(jiān)視作用，使得目前的外科治療、藥物及放射治療均不能根治。,通過(guò)基因治療手段彌補(bǔ)當(dāng)前臨床治療的缺陷，增加其效力，拓寬治療范圍，包括增加治療基因或傳遞途徑的范圍，已成為目前CNS基因

48、治療最主要的研究課題。,CNS腫瘤的基因治療，其主要策略包括病毒載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接裂解、抗癌藥物的激活、抗血管生成、腫瘤細(xì)胞分裂和轉(zhuǎn)移的抑制、免疫增強(qiáng)和誘導(dǎo)凋亡?？梢詮陌┗颉⑸L(zhǎng)因子及其復(fù)合體基因，腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞周期調(diào)控因子等幾方面實(shí)施治療。,前體藥物的激活一直是腦腫瘤基因治療研究的主要方法。最早用于腦腫瘤轉(zhuǎn)基因治療研究的是HSV胸腺核苷酸激酶（thymidine kinase，TK）基因，這種酶可以將丙氧

49、鳥苷轉(zhuǎn)化為一種毒性核苷酸類似物，從而干擾了DNA合成導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。,但以下缺陷使其臨床應(yīng)用受到限制：基因產(chǎn)物本身的抗原性，使表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)胞發(fā)生非特異性或分裂前死亡；核苷酸類似物的不擴(kuò)散性，使其只能在具有縫隙連接的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。,近年來(lái)，針對(duì)前體藥物激活和抗癌藥物增效的研究策略，其數(shù)量在迅速增多。例如，細(xì)菌來(lái)源的胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase）可激活5-氟胞嘧啶，變成5-氟尿嘧啶，后者是一種常用的

50、化療藥，作用類似于丙氧鳥苷。,自殺基因： 某些病毒或細(xì)菌產(chǎn)生的酶,,藥物前體,,細(xì)胞毒性物質(zhì),酶基因(cd),腫瘤細(xì)胞,,,,,表達(dá)相應(yīng)的酶類(CD),藥物前體(5-FCyt),,細(xì)胞毒性物質(zhì)(5-Fura),,殺死腫瘤細(xì)胞,,6、腦缺血,缺血性腦損害（血流的減慢或出血的毒性）導(dǎo)致的變性表現(xiàn)為神經(jīng)功能下降和漸進(jìn)性形態(tài)學(xué)改變。腦細(xì)胞缺氧時(shí)，通過(guò)誘導(dǎo)厭氧糖酵解來(lái)獲得能量消耗，可引起興奮性氨基酸釋放、Ca2+和Na+過(guò)

51、度超載、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性改變和自由基損害。增加營(yíng)養(yǎng)因子、抗凋亡分子和神經(jīng)遞質(zhì)等幾種基因治療方法已在研究。,缺血性后神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制的證實(shí)，使研究者著眼于減慢或阻止這種損害的發(fā)生。在缺血發(fā)生之前或之后，通過(guò)HSV增強(qiáng)子載體介導(dǎo)bcl-2基因轉(zhuǎn)移，可保護(hù)神經(jīng)元免受缺血性損害引起的細(xì)胞死亡。應(yīng)用Ad介導(dǎo)白細(xì)胞介素－1受體拮抗劑，能明顯縮小梗塞范圍和降低局部缺血后的炎癥反應(yīng)。,Ad介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡抑制蛋白（neuronal apopt

52、osis inhibitory protein，NAIP）可縮小大鼠海馬缺血損傷的范圍。應(yīng)用HSV載體表達(dá)72 Kda熱休克蛋白，也可暫時(shí)提高局部缺血區(qū)神經(jīng)元的存活。腺病毒已被證實(shí)能有效地介導(dǎo)腦血管及腦膜轉(zhuǎn)基因，具有血管擴(kuò)張功能酶的基因轉(zhuǎn)移能減弱缺血損害，ex vivo缺血治療包括移植NGF基因修飾工程細(xì)胞至海馬，保護(hù)CA1和CA2區(qū)的神經(jīng)元免受損害。,7、疼痛,鞘內(nèi)和腦內(nèi)病毒載體介導(dǎo)的基因注射是一種有希望的疼痛治療方法

53、。在大鼠模型中，腦脊液中注射一種克隆了內(nèi)源性阿片肽…β-內(nèi)啡肽基因的重組腺病毒，可誘導(dǎo)軟腦膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可釋放β-內(nèi)啡肽基因進(jìn)入腦脊液，使得這種神經(jīng)肽更容易接近阿片受體，結(jié)果可以明顯減輕炎性過(guò)敏疼痛。用重組HSV將前腦啡肽基因傳遞至杏仁核，亦可短期內(nèi)阻止疼痛發(fā)生。,8、 癲癇,隨著癲癇發(fā)病機(jī)制中多基因因素的證實(shí)，許多探索已開始集中于基因治療。正在研究的方法包括：應(yīng)用HSV擴(kuò)增子載體傳遞熱休克蛋白（HSP72），保

54、護(hù)海馬神經(jīng)元免受海藻酸的毒性損害。應(yīng)用Ad介導(dǎo)谷氨酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)移，增加抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的合成。應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)膽囊收縮素，一種抗驚厥和抗阿片神經(jīng)肽，腦室內(nèi)給藥可暫時(shí)消除聲源性驚厥發(fā)作。,Gene Therapy,For complex partial seizures: TLEA promising approach for alternative treatment of epileptic patients who

55、 are resistant to conventional AEDs.,vector,Adeno-Associated virus(AAV)Safe: never asssociated with human diseaseStable: efficient, non-immunogenic, nano particle(20 nm) with limited capacity～

56、 5 kbPersist: >99%,Target Gene and Results,AAV 2 containing GABRA4 promotor to drive transgene expression in dentate gyrus(DG) after status epilepticus(SE).Increasing GABRA1 mRNA and protein expression i

57、n DG at 1-2 weeks after SE.,Resulting in a threefold increase in mean seizure-free time after SE and a 60% decrease in the number of rats developing epilepsy(recurrent spontaneous seizures) in the first 4 weeks after SE.

58、,Altering GABR subunit expression can affect the development of epilepsy and suggest that alpha1 subunit levels are important determinants of inhibitory function in hippocampus.,rAAV containing human NPY (neuropeptid

59、e Y) gene injected into rat hippocampus. Long-lasting peptide expression and effectively suppresses acutely induced seizures and delays epileptogenesis in animal models.,Chronic epilepsy with spontaneous seizures(SS) mi

60、micking TLE.4 weeks later, control rats showed a 300% average increase in SS frequency. In the rAAV-NPY groupe,80% of rats did not show progression in SS, and 4 out of 10 showed 50%reduction in SS frequency.,Hippocampal

61、 NPY significantly increasing in rAAV-NPY Rats.Suppresses SS and arrests the underlying disease process and represents a promising new therapeutic strategy.,基因治療在目前是尚不成熟的治療手段。要將神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療從實(shí)驗(yàn)研究過(guò)度到臨床應(yīng)用可能還需要數(shù)年時(shí)間。目前神經(jīng)系統(tǒng)

62、疾病進(jìn)行臨床基因治療研究的只有腦腫瘤。人們不應(yīng)幻想在一些重大技術(shù)難題沒有攻克以前，神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療會(huì)在短時(shí)間內(nèi)就會(huì)有重大突破。,基因治療目前要解決的幾個(gè)主要問(wèn)題是：尋找更多更有價(jià)值的目的基因；深入研究精確調(diào)控目的基因表達(dá)的機(jī)制，組建具有調(diào)控序列的基因；構(gòu)建組織特異性或定向基因表達(dá)的載體；,穩(wěn)定地將其轉(zhuǎn)入有絲分裂后的細(xì)胞；克服病毒載體引起的免疫反應(yīng)等。而CNS基因治療更面臨獨(dú)特的問(wèn)題，如CNS組織的復(fù)雜性、細(xì)胞種類的多樣性，