大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1、1.成年大鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)?步驟1.獲得海馬細(xì)胞?大鼠乙醚麻醉，斷頭處理；?迅速解剖海馬組織，置于含有2ml4℃的HibernateAB27的35mm的培養(yǎng)皿中；?隨后將其移入含有同上培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，去除腦膜及多余的腦白質(zhì)（？）；?將海馬移入組織切碎機(jī)冷處理臺(tái)面上事先用HibernateAB27潤(rùn)濕的濾紙上，沿海馬長(zhǎng)軸將組織切成0.5mm的薄片，隨后將其移入含有5ml4℃的HibernateAB27的離心管中；?30℃震蕩8min。?

2、大吸管將其移入含有木瓜蛋白酶（預(yù)熱至30℃）的離心管，置于170rpm的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)（保持組織片懸浮狀態(tài)），30℃水域溫育30min；?將海馬組織切片移入15ml含有2mlHibernateAB27的離心管中，30℃溫育5min，吸管吹打10次（30s），靜置2min，將上清移入另一離心管，重復(fù)上述步驟2次；2.梯度分離?將細(xì)胞懸液加入Nycoprepgradient（4ml）的上方，室溫，1900rpm，離心15min；去除最上方的碎片；

3、吸管收集含有細(xì)胞的部分；用5mlHibernateA稀釋；第三層富含神經(jīng)元；將第四層用2mlB27:NeurobasalA重懸，1100rpm離心1min；3.蓋玻片處理：50ugmL多聚D賴氨酸（無(wú)菌水溶解）包被過夜，吸去多余的多聚賴氨酸，無(wú)菌水漂洗一次，自然干燥1h；4.?細(xì)胞接種：以目標(biāo)密度稀釋于B27:NeurobasalA，以每蓋玻片60到120Ul接種，置于5%CO2:9%O2中孵育1h；?將蓋玻片移入24孔培養(yǎng)板中每孔以0

4、.4ml37℃B27NeurobasalA漂洗一次，去除未貼壁細(xì)胞及細(xì)胞碎片；改用0.4ml的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；?培養(yǎng)后4天，每34天更換一半培養(yǎng)基；新的培養(yǎng)基中的FGF2含量是遠(yuǎn)培養(yǎng)基的2倍；1.培養(yǎng)器皿的準(zhǔn)備：培養(yǎng)器皿的準(zhǔn)備：1）溶液瓶——裝配各種溶液——輸液瓶；2）螺口瓶——血清或培養(yǎng)基；3）培養(yǎng)瓶——細(xì)胞培養(yǎng)——一般采用帶螺口的，清洗時(shí)注意防止蓋子中墊片的丟失；相通維持PH的恒定；取出是應(yīng)旋緊開口；2）保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣的潔凈，定期用酒

5、精或紫外線消毒；3）保持培養(yǎng)箱內(nèi)較高的濕度——定期在外箱內(nèi)加水或?qū)o(wú)菌潮濕的紗布置于托盤內(nèi)；(三)高壓蒸汽滅菌器——適用于玻璃器皿、塑料器皿、橡膠制品、金屬制品及培養(yǎng)用水、平衡鹽液、布料的消毒滅菌。1）滅菌的液體應(yīng)置于耐高溫的玻璃器皿中，容量為總?cè)萘康?2~34，瓶塞要有通氣口；5.培養(yǎng)用液：培養(yǎng)用液：(一)水1）培養(yǎng)用水一般使用三蒸水，或者二蒸水去離子處理；高壓蒸汽滅菌后使用；2）新鮮使用，一般不超過2周；3）外購(gòu)的蒸餾水一般為金屬蒸

6、餾器制備，一般需要用石英或玻璃蒸餾器在蒸餾一次(二)平衡鹽：1）取材和分離細(xì)胞中，細(xì)胞必須全程維持于生理PH和滲透壓的平衡鹽液中；2）以酚紅作為指示劑，正常呈紅色，酸性呈黃色，堿性呈紫色；酚紅一般對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，但在強(qiáng)光下可產(chǎn)生細(xì)胞毒性。3）碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)在空氣中易變堿；磷酸鹽緩沖系統(tǒng)、HEPES可維持空氣中的酸堿平衡。4）配置時(shí)：用新鮮培養(yǎng)用水配置；溶質(zhì)稱量應(yīng)準(zhǔn)確；先溶解CaMg，再溶解其他成分，且前一種物質(zhì)溶解后再溶解后一種物質(zhì)；先將

7、物質(zhì)溶解于少量液體，配置完后再定容；5）用高壓蒸汽滅菌（8磅15min）或過濾除菌6）滅菌后4℃貯存7）配置的平衡鹽的PH并不是細(xì)胞最合適的，根據(jù)情況調(diào)節(jié)PH至7.2~7.48）Hanks（HBSS）——DHanks（不含CaMg，不含葡萄糖）(三)血清：1）外觀：清亮透明，棕黃色或土黃色，無(wú)沉淀或極少沉淀，比較粘稠2）清蛋白35~45g球蛋白20g血紅蛋白越低越好3）存儲(chǔ)：?新購(gòu)血清——56℃30min熱滅活（高品質(zhì)胎牛血清及新生牛血