維吉尼亞鏈霉菌IBL14中i-b-svi型CRISPr-Cas系統(tǒng)及青霉素代謝相關(guān)酶基因自敲除.pdf

1、維吉尼亞鏈霉菌IBL14(Streptomyces virginiae IBL14)是一株革蘭氏陽性菌，能夠高效轉(zhuǎn)化及降解皮質(zhì)醇、膽固醇、黃銅和孕酮等甾醇類化合物，是本實驗室在制藥廠周圍的污泥中分離并純化的一株放線菌。在先前的抗生素抗性篩選研究中，發(fā)現(xiàn)IBL14菌株能夠在含較高濃度青霉素的培養(yǎng)基中生長，而青霉素一般為真菌中的霉菌所產(chǎn)生。為了揭示這種現(xiàn)象，本實驗室通過Illumina Hiseq2000平臺測序?qū)ζ淙蚪M進行了測序，并對

2、測序得到的數(shù)據(jù)進行過濾、組裝和評估，然后依賴數(shù)據(jù)庫GO、KEGG和Swiss-Prot，以及NR和COG對獲得的ORF進行基因功能通用注釋，最終篩選出7個可能與青霉素代謝相關(guān)的酶基因，分別為異青霉素N異構(gòu)酶(sviipe)、青霉素酰胺酶（svipam1和svipam2）和β-內(nèi)酰胺酶(svibla1、svibla2、svibla3、svibla4)。
　　CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物長期進化過程中形成的一種免疫防御機制，廣泛

3、存在于古細(xì)菌和真細(xì)菌中。CRISPR位點是由一系列高度保守的正向重復(fù)序列(repeats)和間隔序列(spacer)排列組成的多段R-S結(jié)構(gòu)，其位點附近存在一系列CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR association protein，cas protein)，依據(jù)Cas蛋白的差異，將其分為兩類六型。雖然含有CRISPR-Cas系統(tǒng)的生物近2000種，但能起到基因編輯作用的僅有CRISPR-Cas9和Ⅴ型Cpf1。CRISPR-Cas

4、系統(tǒng)作為一種新的基因編輯工具，它克服了傳統(tǒng)技術(shù)的一些缺點，如操作繁瑣、耗時長、成本高等，使得基因編輯更加精準(zhǔn)、高效、快速。IBL14菌株全基因組組分分析表明，其染色體中存在CRISPR系統(tǒng)。Cas蛋白預(yù)測和比對發(fā)現(xiàn)，其染色體上含有Cas7、Cas5、Cas3、Cas4、Cas1和Cas2，并且這些蛋白位于同一個操縱子上。其中，Cas3具有DNA剪切作用。因此，本實驗室將其命名為I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)。
　　本論文

5、首次應(yīng)用IBL14菌株自身I-B-svi型CRISPR-Cas系統(tǒng)對青霉素代謝相關(guān)酶基因進行編輯，實現(xiàn)了異青霉素N異構(gòu)酶(sviipe)基因的插入;青霉素酰胺酶（svipam1和svipam2）和β-內(nèi)酰胺酶(svibla1、svibla2、svibla3、svibla4)基因的單敲除;青霉素酰胺酶（svipam1）和異青霉素N異構(gòu)酶(sviipe)以及青霉素酰胺酶（svipam1）和β-內(nèi)酰胺酶（svibla1）基因的雙敲除。編輯中，

6、選擇了不同的PAM位點、template和repeat序列。其中，svipam1的敲除結(jié)果表明，PAM位點為ttc的敲除效率較tcc稍高;svibla1的敲除結(jié)果表明，偏長的template敲除效率較短的template敲除效率高，但template短至400bp同樣能實現(xiàn)基因敲除;而CRISPR1和CRISPR2的repeat序列則無明顯差異。然后，對青霉素代謝相關(guān)酶基因敲除后的菌株進行初步的青霉素抗性檢測實驗，進一步驗證基因敲除的正

7、確性，同時初步驗證內(nèi)酰胺酶基因的功能。在具體實施過程中，僅需要進行編輯模板片段(editing templets)和靶向基因片段（target constructs）的設(shè)計，構(gòu)建出含有向?qū)NA(single guide RNA)和基因編輯模板的敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到IBL14原生質(zhì)體中，篩選得到敲除后的重組子，對重組子染色體進行PCR擴增，再進行PCR產(chǎn)物的測序分析即可。該方法操作簡單、耗時短、效率高，不僅為基因編輯提供了一種新的方向，同時