利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建MC3R基因敲除豬.pdf

1、黑素皮質(zhì)素受體（Melanocortin Receptors，MCRs）是G-蛋白偶聯(lián)受體，迄今為止共發(fā)現(xiàn)五個(gè)成員，在黑素皮質(zhì)素(Melanocortin，MC)刺激下，都能夠增加胞內(nèi)cAMP的濃度，啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)。但是MCRs各成員間生理作用迥異，其中MC3R基因在下丘腦中高表達(dá)，對(duì)控制動(dòng)物食欲和調(diào)節(jié)能量平衡中發(fā)揮重要作用:MC3R基因的突變與人類(lèi)肥胖密切相關(guān)，被認(rèn)為是代謝綜合癥相關(guān)的候選基因;此外，豬的采食和能量分配對(duì)其生長(zhǎng)速度、胴體

2、瘦肉率等經(jīng)濟(jì)性狀具有重要影響，所以MC3R基因在豬的育種上也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但其確切生理功能、作用機(jī)制還不清楚?；蚯贸齽?dòng)物模型是確定一個(gè)基因生理功能的最佳材料，但至今未見(jiàn)MC3R基因敲除豬模型的報(bào)道。與嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型相比，豬的各項(xiàng)生理指標(biāo)與人類(lèi)更為接近，所以建立MC3R基因敲除模型豬不僅可以用于明確MC3R的生理作用，為治療肥胖綜合癥提供新的思路和方法，還可以評(píng)估其在豬分子育種中的價(jià)值。
　　本文采用新型基因組編輯技術(shù)CRI

3、SPR/Cas9系統(tǒng)，在中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬(Chinese Experimental Mini pig，CEMP)MC3R基因起始密碼子的上游12bp、終止密碼子下游45 bp以及MC3R基因的CDS區(qū)起始密碼子下游288 bp和終止密碼子上游61 bp設(shè)計(jì)四個(gè)MC3R基因敲除靶位點(diǎn)，構(gòu)建MC3R-pX330基因敲除載體并驗(yàn)證各載體的打靶效率。利用構(gòu)建好的MC3R-pX330基因敲除載體，通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，篩選獲得具有G41