基于pH指示劑顯色效應(yīng)的改進型酶聯(lián)免疫檢測方法研究.pdf

1、傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)易受干擾，靈敏度低等一些缺點限制了其廣泛應(yīng)用。近些年對傳統(tǒng)ELISA的改進已經(jīng)做了許多努力，使其在生物傳感檢測中得到了很好的應(yīng)用。納米材料問世之后由于其一系列優(yōu)點，如比表面積大，吸附能力強，催化效率高，生物相容性好等一直備受關(guān)注。非金屬的納米材料具有納米材料的優(yōu)點，不含有貴金屬，綠色前驅(qū)體，成本低、無污染，因此受到更多的青睞。廉價的pH指示劑代替酶的使用，降低了實驗成本，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，反應(yīng)后顏色變化顯

2、著，實驗結(jié)果可視化。本文中，利用非金屬納米材料作為信號載體，pH指示劑作為信號直接放大平臺通過π-π共軛負載到納米材料上，疾病標記物與納米材料通過化學(xué)鍵牢固結(jié)合，在96-微孔板中構(gòu)建成完整的免疫傳感器。向微孔板的孔中加入定量的釋放劑，釋放劑與疏水性的指示劑分子反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為親水性的離子從納米材料上釋放到溶液中，引起溶液顏色發(fā)生變化。該方法實現(xiàn)了對疾病標記物的可視化超靈敏檢測。具體檢測內(nèi)容如下:
　　(1)設(shè)計了一種基于酚酞(PP)指

3、示劑變色效應(yīng)的改進傳統(tǒng)ELISA，實現(xiàn)對癌胚抗原(CEA)的高靈敏可視化檢測。類石墨烯氮化碳(g-C3N4)納米材料由于具有較大的比表面積，容易制備，化學(xué)穩(wěn)定性高，成本低，被羧基化后的g-C3N4(cC3N4)被用來作為該體系中信號分子的載體。免疫傳感器制備成功后，加入堿性釋放劑(AS)，PP分子遇堿反應(yīng)生成離子，釋放到溶液中，引起溶液顏色發(fā)生變化。優(yōu)化實驗條件后，實現(xiàn)了對CEA的高靈敏可視化檢測。檢測范圍是0.5 pg/mL到100

4、ng/mL，最低檢測限(LOD)為0.34 pg/mL。這種方法是一種無酶的改進型ELISA，可以命名為PILISA。PILISA遵循酶聯(lián)免疫吸附測定形式，同時避免了傳統(tǒng)ELISA的缺點，為實際臨床檢測提供了一種很有發(fā)展前景的方法。
　　(2)心血管疾病是引起全球死亡率高的主要原因之一，而心臟病標志物肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)的測定分別用于檢測和診斷急性心肌梗死和冠狀動脈綜合癥。使用聚多巴胺(PDA)包裹的g-

5、C3N4(PDA-C3N4)作為信號載體，是由于PDA表面具有豐富的官能團，既可以與生物分子結(jié)合，又可以吸附大量的指示劑分子百里香酚酞(TP)和溴酚紅(BR)，設(shè)計的新型免疫傳感器實現(xiàn)了對心臟病標記物cTnⅠ和CRP的可視化雙檢測。靈敏度高，檢測范圍寬(cTnI:0.5 pg/mL-8 ng/mL; CRP:0.5 pg/mL-10 ng/mL)，其中LOD分別為0.32 pg/mL和0.28 pg/mL。根據(jù)檢測結(jié)果可以看出，該免疫傳

6、感器的穩(wěn)定性、選擇性和重現(xiàn)性都是令人滿意的。
　　(3)介孔二氧化硅(MSN)由于其特殊的孔狀結(jié)構(gòu)，比表面積大和易功能化等優(yōu)點得到了廣泛的應(yīng)用。將MSN功能化，使其孔內(nèi)帶有芳香結(jié)構(gòu)，能與疏水性的pH指示劑分子通過π-π共軛結(jié)合。MSN與聚乙烯亞胺(PEI)作用，使其表面顯正電性，與表面帶有負電的抗體分子作用連接。因此功能化的MSN作為信號載體參與構(gòu)建免疫傳感器，實現(xiàn)了對前列腺抗原(PSA)的可視化高靈敏檢測。檢測濃度范圍寬（0.5