巨大肝細胞癌根治術后近期復發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床與相關蛋白組學初步研究.pdf

1、目的:
　　應用同位素標記相對和絕對定量蛋白組學技術(iTRAQ)鑒定和篩選與巨大肝細胞癌根治術后近期復發(fā)轉(zhuǎn)移相關的差異蛋白,試圖找到術后近期復發(fā)轉(zhuǎn)移預測新指標和治療新靶點。
　　方法:
　　1.回顧性分析166例巨大肝細胞癌患者的臨床病理資料,根據(jù)術后近期復發(fā)轉(zhuǎn)移時間,分為術后6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組和6~12個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組,應用Logistic回歸模型分不同時間段對臨床病理因素進行單因素和多因素分析,并建立術后近期復發(fā)

2、轉(zhuǎn)移概率預測數(shù)學模型。
　　2.蛋白組學實驗:應用巨大肝細胞癌手術切除組織標本作為實驗對象,根據(jù)臨床隨訪復發(fā)轉(zhuǎn)移與否分為3組(隨訪時間24個月):術后6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組(n=20),術后6~12個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組(n=20)及未復發(fā)轉(zhuǎn)移組;對這些組織標本進行蛋白提取、定量和酶解,應用iTRAQ試劑標記(117標記6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組,119標記6~12個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組,121標記未復發(fā)轉(zhuǎn)移組)二維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/M

3、S)聯(lián)用技術進行分析。利用Protein Pilot軟件(版本4.2)對MS/MS肽段進行分析,在Intemational Swissprot(20111015,human)數(shù)據(jù)庫中鑒定蛋白質(zhì)并定量。鑒定蛋白的比值117:121或119:121大于2倍或小于0.5倍(P<0.05)認為二者之間存在表達差異。應用MetaCore(GeneGo公司)軟件對差異表達蛋白進行GO分析,包括亞細胞定位、分子功能和生物學過程。應用IPA(Ingen

4、uity Pathway Analysis)軟件分析差異表達蛋白參與的信號通路和蛋白間相互作用的網(wǎng)絡。
　　3.應用蛋白組學實驗部分的組織標本和分組標準,采用免疫印跡(Western Blot)、免疫組化和實時熒光定量PCR(Q-PCR)技術從蛋白和mRNA水平檢測差異蛋白Galectin-4、S100A12和Alpha-methylacyl-CoA racemase(AMACR)表達情況,驗證質(zhì)譜的準確性。
　　4.采用構

5、建組織芯片結合免疫組化方法檢測感興趣的目標蛋白Galectin-4在73例巨大肝癌術后1年內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移與73例未復發(fā)轉(zhuǎn)移的癌組織及配對的癌旁組織和10例正常肝組織中的表達情況,并探討Galectin-4蛋白表達與各臨床病理參數(shù)及與復發(fā)轉(zhuǎn)移的關系。
　　結果:
　　1.術后6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移率為36.7％(61/166),術后6~12個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移率為27.1%(45/166);Logistic單因素分析提示術前血清AFP值≥12

6、10ng/ml(X4)、腫瘤包膜(X7)、鏡下脈管癌栓(X10)、術后癌細胞病理分級(X11)與術后6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移有關,術前血清AFP值≥1210ng/ml(X4)和鏡下脈管癌栓(X10)與術后6~12個月復發(fā)轉(zhuǎn)移有關;多因素分析提示,術后6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素為術前血清AFP值≥1210ng/ml(X4)、腫瘤有包膜(X7)和鏡下脈管癌栓(X10);術后6~12個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素為術前血清AFP值≥1210ng/m

7、l(X4)和鏡下脈管癌栓(X10);術后6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移概率的預測方程為P=Y/(1+Y),Y=EXP(-0.852+0.753X4-1.273X7+2.524X10);術后6~12個月復發(fā)轉(zhuǎn)移概率的預測方程為P=Y/(1+Y),Y=EXP(-0.804-0.897X4+0.923X10)。
　　2.利用Protein Pilot軟件(版本4.2)對MS/MS肽段進行分析,并在Intemational Swissprot(2011

8、1015,human)數(shù)據(jù)庫中搜索,共鑒定出1407種蛋白;基于篩選差異表達蛋白的條件,共篩選出了87個差異表達蛋白;與未復發(fā)轉(zhuǎn)移組比較,6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組差異表達蛋白有46個,其中15個蛋白表達上調(diào),31個蛋白表達下調(diào),6~12月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組差異表達蛋白有49個,其中33個蛋白表達上調(diào),16個蛋白表達下調(diào);6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組、6~12月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組共同的差異表達蛋白有8個,分別是 Galectin-4、Lactotransferrin

9、、Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B、Biliverdin reductase A、60 kDa SS-A/Ro ribonucleoprotein、Apolipoprotein A-II、Protein S100A12和Alpha-methylacyl-CoA racemase(AMACR)。
　　3.87個差異表達蛋白生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)大部分定位細胞質(zhì),分

10、子功能主要是蛋白結合,生物學過程主要體現(xiàn)在代謝和調(diào)控。差異蛋白富集度最高的生物通路是EIF2信號通路,發(fā)現(xiàn)差異蛋白富集度最高的蛋白網(wǎng)絡是以ERK1/2為核心的調(diào)控網(wǎng)絡,共有14個差異表達蛋白參與。
　　4.部分差異表達蛋白驗證結果顯示,與未復發(fā)轉(zhuǎn)移癌組織比較,Galectin-4蛋白和相應的mRNA表達在6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移癌組織、6~12月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移癌組織中均下調(diào),與蛋白組學結果一致;S100A12和AMACR蛋白與相應的mRNA表

11、達在6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組表達下調(diào),6~12月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組表達上調(diào),與蛋白組學結果一致。
　　5.Galectin-4 mRNA的表達在巨大肝癌組織中表達上調(diào),在癌旁和正常肝組織中表達均下調(diào),各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);擴大臨床組織樣本量采用組織芯片結合免疫組化的方法檢測Galectin-4在巨大肝癌中表達情況,結果顯示Galectin-4在巨大肝癌組織中陽性表達率為39.0%(57/146),明顯低于癌旁組織71.9%

12、(105/146)和正常肝組織80%(8/10),差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05);Galectin-4在12個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移組陽性表達率為19.1%(14/73),明顯低于未復發(fā)轉(zhuǎn)移組58.9%(43/73),兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000);Galectin-4蛋白陰性表達與性別、年齡、有無合并肝硬化、是否合并乙肝病毒感染、腫瘤包膜、癌細胞病理分化無關,而與術前血清AFP值和鏡下脈管癌栓有關(P均<0.05);Kapl

13、an-Meier生存曲線分析顯示Galectin-4陰性表達組3年生存率24.0%低于陽性表達組34.8%(χ2=6.589,P=0.010);Galectin-4陰性表達組1年無瘤生存率53.1%明顯低于陽性表達組83.6%(χ2=5.836,P=0.016)。
　　結論:
　　1.巨大肝細胞癌術后12個月復發(fā)轉(zhuǎn)移率高;術前血清AFP值、腫瘤包膜、微血管侵犯是巨大肝細胞癌根治術后近期復發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素。
　　2.巨大

14、肝細胞癌術后6個月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移和6~12月內(nèi)復發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素不同,復發(fā)轉(zhuǎn)移概率預測的數(shù)學模型不同。
　　3.經(jīng)驗證確認的差異表達蛋白Galectin-4、S100A12、AMACR有望成為巨大肝細胞癌術后近期復發(fā)轉(zhuǎn)移潛在的預警蛋白,其分子機制需進一步研究。
　　4.Galectin-4蛋白在巨大肝癌組織中表達下調(diào);Galectin-4表達與術后近期復發(fā)轉(zhuǎn)移有關,Galectin-4低表達提示3年生存率和1年無瘤生存率低,可為