Mre11蛋白相互作用蛋白的篩選及驗證.pdf

1、生物體基因組DNA時常會受到一系列內(nèi)源或外源DNA損傷試劑的作用而出現(xiàn)DNA斷裂。如果DNA雙鏈斷裂不能得到及時有效地修復(fù)，會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，如染色體缺失，多拷貝染色體等，引起多種人類疾病。在長期的進化過程中，生物有機體形成了一系列DNA損傷修復(fù)機制，以應(yīng)對損傷的DNA。MRN復(fù)合物是參與DNA損傷修復(fù)的一個關(guān)鍵分子，由Mre11、NBS1和RAD50蛋白組成。研究發(fā)現(xiàn)MRN復(fù)合物在DNA雙鏈損傷修復(fù)、同源重組、非同源末端連接、端粒

2、結(jié)構(gòu)維持、細胞周期檢驗點激活、DNA復(fù)制順利進行，以及維持基因組的穩(wěn)定性等方面都發(fā)揮著重要的作用，因此對于MRN復(fù)合物功能以及其發(fā)揮功能的機制的研究就顯得至關(guān)重要。
　　 本文以Mre11蛋白N端335個氨基酸殘基作為誘餌蛋白(Mre11N335)，通過酵母雙雜交系統(tǒng)，從黑腹果蠅21小時胚胎cDNA文庫中篩選與Mre11蛋白相互作用的分子，從而對其發(fā)揮功能的機制進行深入研究。以CG1945酵母菌作為宿主菌，通過SD-T-L-H-

3、3AT營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基進行初篩，初篩得到的陽性克隆通過檢測β半乳糖苷酶活性進一步篩選，將篩選到的陽性克隆連續(xù)涂三次SD-T-L-H-3AT營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)板，丟失酵母菌中沒有與Mre11N335蛋白發(fā)生相互作用的文庫質(zhì)粒。提取酵母菌中的質(zhì)粒，用通用引物PCR擴增文庫插入片段，HaeⅢ酶切PCR產(chǎn)物，根據(jù)PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物片段大小對克隆進行分組歸類，去除重復(fù)。將分類后得到的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，再次進行PCR擴增，HaeⅢ酶切，進一

4、步進行分組歸類。將分類后得到的質(zhì)粒進行測序，測序結(jié)果與果蠅基因的cDNA序列進行比對，將與果蠅基因cDNA序列讀碼框一致的克隆挑選出來進行體內(nèi)和體外再驗證。體內(nèi)通過共轉(zhuǎn)AH109酵母菌、AH109酵母菌和Y187酵母菌雜交以及移碼突變?nèi)齻€實驗來驗證。通過體內(nèi)再驗證篩選到五個與Mre11N335蛋白相互作用的基因，分別為CG4035(eIF-4E)，CG1216(mri)，CG4916(me31B)，CG5468(TweedleM)和CG