促腎上腎皮質(zhì)激素釋放因子1型受體經(jīng)cAMP-PKA信號(hào)通路對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、背景:膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)腫瘤，統(tǒng)計(jì)資料表明其發(fā)生率約占顱內(nèi)腫瘤的40-50％，其多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與正常腦組織間常無(wú)明顯分界，易侵犯重要神經(jīng)結(jié)構(gòu)，具有預(yù)后差、復(fù)發(fā)率、高致死率的特點(diǎn)。傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)切除為主，輔以放療、化療，血腦屏障的存在使常規(guī)化療藥物難以發(fā)揮作用，預(yù)后不佳。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展尋找新的治療手段成為是神經(jīng)外科研究領(lǐng)域的主要內(nèi)容之一。
　　促腎上腺激素釋放因子(corticotropin-releasing

2、 factor CRF)是1981年Vale等從綿羊的下丘腦中提取分離出的含有41個(gè)氨基酸的激素類神經(jīng)肽[1]。多分布于人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)下丘腦室旁核，外周系統(tǒng)中也分布廣泛。CRF主要作用于下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA），調(diào)節(jié)機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下的神經(jīng)內(nèi)分泌，自主神經(jīng)，免疫反應(yīng)等方面的協(xié)調(diào)作用[4]。近年來(lái)許多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)CRF相關(guān)肽及其受體在許多腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中都發(fā)揮了重要的作用。如Grazia等發(fā)現(xiàn)CRF能通過(guò)CRFR1來(lái)抑制人類子宮內(nèi)膜癌[

3、2]細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞[3]的增殖;Erini等發(fā)現(xiàn)CRF通過(guò)激活CRFR1誘導(dǎo)PC12大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡[5];并且Minas等也發(fā)現(xiàn)CRF通過(guò)激活CRFR1來(lái)增加FasL在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡[6]。但是，CRF對(duì)腦膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。我們?cè)O(shè)計(jì)并實(shí)施了本實(shí)驗(yàn)。
　　目的:探索CRF及其受體抑制劑Antalarmin作用于人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞后，對(duì)比細(xì)胞內(nèi)的cAMP、PKA含量的變化。探

4、討CRF及其受體在環(huán)磷腺苷酸-蛋白激酶A通路(cAMP-PKA)中的信號(hào)傳導(dǎo)，以及對(duì)U87細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法:
　　1、Elisa方法法檢測(cè)cAMP的濃度
　　復(fù)蘇U87細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每組置3個(gè)重復(fù)孔。37℃，5％CO2，濕化空氣培養(yǎng)24h后，分別加入①DMEM培養(yǎng)基作為空白對(duì)照、②含CRF的DMEM培養(yǎng)基（濃度為10-9mol/L）、③含Antalarmin的DMEM培養(yǎng)基（濃度為10-8mol/L

5、）、④含CRF和的DMEM培養(yǎng)基（濃度為別為10-9mol/L、10-8mol/L）2mL，作用24小時(shí)后，低溫離心提取細(xì)胞，加入IBMX1mL（濃度為1mg/mL）后，超聲裂解法裂解細(xì)胞，低溫離心提取上清液后，在吸光度值檢測(cè)儀中檢測(cè)cAMP濃度。
　　2、熒光定量PCR檢測(cè)PKA基因表達(dá)
　　Trizol法提取細(xì)胞總RNA，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。應(yīng)用Prim

6、er Premier5.0軟件，設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因，由北京賽百盛公司合成。置于QIAGENRotor-Gene Q Real Time RT-PCR儀，95℃預(yù)變性2min;95℃變性15s，60℃退火/延伸30s，40個(gè)循環(huán);最后，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析[7]，計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對(duì)于對(duì)照樣品目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，記錄結(jié)果數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1、Elisa

7、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP:同時(shí)間組的，不同處理的細(xì)胞樣本存在差異，(F12h=8.181,P=0.008＜0.05; F24h=7.821, P=0.009＜0.05;F36h=5.820,P=0.021＜0.05);不同時(shí)間組的cAMP濃度存在減少趨勢(shì)。
　　2、熒光定量PCR檢測(cè):相同時(shí)間不同處理方式各組的PKA的mPNA表達(dá)有差別(F12h=175.926，P＜0.05;F24h=137.956，P＜0.05; F36h=129.

8、280，P＜0.05)，其中均表明CRF處理組的PKA的mPNA表達(dá)高于同時(shí)間點(diǎn)其它處理組。
　　結(jié)論:
　　1、Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CRF作用于U87細(xì)胞后，增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，可能通過(guò)第二信使cAMP促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，且隨時(shí)間推移，細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度減低。
　　2、熒光定量PCR結(jié)果顯示:PKA的mRNA的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)cAMP的表達(dá)趨勢(shì)一致。結(jié)合以前研究CRF與U87細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，CRF促進(jìn)U87