miR-24對(duì)糖尿病大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究過表達(dá)miR-24對(duì)糖尿病大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生的影響，并探討其分子機(jī)制。
　　方法：將60只SPF級(jí)雄性SD大鼠(約170g)喂以高糖高脂飼料4周，繼以小劑量鏈脲佐菌素（STZ，45mg/kg）單次腹腔注射，STZ注射3d/7d后，尾靜脈測大鼠空腹血糖，評(píng)價(jià)糖尿病大鼠模型（空腹血糖≥16.7 mmol/L，造模成功）。誘導(dǎo)建立的糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組(n=12)：假手術(shù)組(Sham組)；頸動(dòng)脈球囊損傷+生理鹽水注

2、射組（PBS組）；頸動(dòng)脈球囊損傷+Ad-Scramble轉(zhuǎn)染組（ Ad-Scramble組）；頸動(dòng)脈球囊損傷+Ad-miR-24轉(zhuǎn)染組（Ad-miR-24組）。將重組腺病毒載體或生理鹽水在體轉(zhuǎn)染球囊損傷后的大鼠頸總動(dòng)脈，14天后處死動(dòng)物，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。免疫熒光檢測腺病毒轉(zhuǎn)染效率， Real-time PCR法測定轉(zhuǎn)染基因miR-24的表達(dá)水平；HE評(píng)估血管損傷后新生內(nèi)膜增生程度；免疫組化及Western blot檢測損傷血管處增殖核

3、抗原（PCNA）含量，以評(píng)價(jià)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖情況；Western blot檢測Wnt4相關(guān)信號(hào)通路Wnt4、Dvl-1、β-catenin、CyclinD1、p21蛋白表達(dá)；Real time PCR檢測CyclinD1、p21的基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1) STZ注射3d/7d后，大鼠空腹血糖明顯升高，且≥16.7 mmol/L。(2)重組腺病毒載體Ad-miR-24轉(zhuǎn)染糖尿病大鼠頸總動(dòng)脈14天后，免疫熒光檢

4、測到GFP的表達(dá)，同時(shí)Real time PCR檢測證實(shí)，轉(zhuǎn)染基因miR-24在頸總動(dòng)脈成功過表達(dá)。(3)與Sham組相比，PBS組和Ad-Scramble轉(zhuǎn)染組內(nèi)膜增生嚴(yán)重，血管腔呈向心或偏心性狹窄，新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂；Ad-miR-24轉(zhuǎn)染組內(nèi)膜增生程度明顯減輕，管腔狹窄不明顯。與PBS組和Ad-Scramble轉(zhuǎn)染組比較，Ad-miR-24轉(zhuǎn)染組頸總動(dòng)脈新生內(nèi)膜面積、內(nèi)膜和中膜面積比(I/M)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

5、P<0.05)，而各組中膜面積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。(4) PBS組和Ad-Scramble轉(zhuǎn)染組在球囊損傷后第14d，免疫組化檢測可見新生內(nèi)膜中大量的PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞，而Ad-miR-24轉(zhuǎn)染組中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較少。與PBS組和Ad-Scramble轉(zhuǎn)染組比較，過表達(dá)miR-24可明顯抑制新生內(nèi)膜PCNA陽性表達(dá)指數(shù)(P<0.05)。同時(shí)，Western blot檢測結(jié)果顯示PCNA蛋白的表達(dá)情況與上述免疫組化結(jié)果一致

6、。(5)與Sham組相比，PBS組和Ad-Scramble轉(zhuǎn)染組Wnt4、Dvl-1、β-catenin表達(dá)均顯著增加（P<0.05)；而Ad-miR-24轉(zhuǎn)染組中以上Wnt4通路相關(guān)的蛋白分子表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。PBS組與Ad-Scramble組相比，以上蛋白分子的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。(6)與Sham組相比，PBS組和Ad-Scramble轉(zhuǎn)染組中促增殖分子CyclinD1基因和蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P<0

7、.05)。相反，抗增殖分子p21在基因和蛋白水平上均顯著降低（P<0.05)；與PBS組和Ad-Scramble轉(zhuǎn)染組相比，Ad-miR-24組中CyclinD1的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），而p21的基因和蛋白水平上均顯著增加（P<0.05）。PBS組與Ad-Scramble組相比，CyclinD1、p21基因和蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：(1) Ad-miR-24重組腺病毒成功轉(zhuǎn)染糖尿