RU486可誘導(dǎo)調(diào)控的單載體慢病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及功能初探.pdf

1、以1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體具有可感染非分裂細(xì)胞、免疫反應(yīng)小、攜帶的基因片段容量大和可整合進(jìn)宿主基因組而長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，因而成為最理想的基因轉(zhuǎn)移載體之一。然而，開發(fā)應(yīng)用于臨床基因治療的慢病毒載體卻要求能嚴(yán)格控制目的基因表達(dá)以確保治療的有效性并減少毒副作用，因此構(gòu)建可人工誘導(dǎo)調(diào)控的慢病毒載體系統(tǒng)意義重大。
　　 RU486誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)以人孕酮受體的突變體為核心，以臨床常用的小分子藥物RU486為誘導(dǎo)劑，

2、在設(shè)計(jì)原理與結(jié)構(gòu)上較其它調(diào)控系統(tǒng)更為先進(jìn)。該系統(tǒng)具有最低的本底表達(dá)和最小的免疫原性，且RU486小分子具有進(jìn)入組織速度快、半衰期短、用量少和毒性小等優(yōu)點(diǎn)，從而使目的基因的表達(dá)調(diào)控更靈敏應(yīng)用更安全有效。將該系統(tǒng)應(yīng)用于慢病毒載體，構(gòu)建RU486誘導(dǎo)調(diào)控的慢病毒載體系統(tǒng)，可在轉(zhuǎn)錄水平上有效控制目的基因定時(shí)定量地表達(dá)，從而擴(kuò)大慢病毒載體用于基因治療的潛能。
　　 然而完整的誘導(dǎo)調(diào)控功能的實(shí)現(xiàn)要求在宿主細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)反式調(diào)控區(qū)和目的基因區(qū)

3、兩個(gè)表達(dá)盒，但因慢病毒包裝需連續(xù)地轉(zhuǎn)錄出全長(zhǎng)基因組，故多表達(dá)盒中引入的額外終止子結(jié)構(gòu)可能對(duì)病毒的正常包裝造成影響。作為解決方案，本研究組設(shè)計(jì)出一段特殊的單向終止子元件，通過正反向同時(shí)插入兩個(gè)表達(dá)盒，很好的解決了單個(gè)慢病毒載體表達(dá)雙基因的問題，并且已在四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)中得到成功應(yīng)用。本課題依據(jù)上述原理構(gòu)建全新的RU486可誘導(dǎo)調(diào)控的單載體慢病毒系統(tǒng)，并通過體外試驗(yàn)評(píng)估其作用效果。試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)一段Linker序列并分步引入誘導(dǎo)調(diào)控系統(tǒng)的反式調(diào)

4、控元件和目的基因表達(dá)盒，最終克隆至第三代自身失活型慢病毒載體中，得到RU486可誘導(dǎo)調(diào)控的單載體慢病毒質(zhì)粒Lenti-RU-E。
　　 慢病毒的生產(chǎn)包裝效率是直接影響其相關(guān)功能研究和應(yīng)用的關(guān)鍵因素，本試驗(yàn)以商業(yè)化慢病毒載體作為研究對(duì)象，對(duì)磷酸鈣法和Effectene轉(zhuǎn)染試劑法包裝病毒的實(shí)際效果進(jìn)行綜合比較，并最終選擇磷酸鈣法作為后續(xù)病毒生產(chǎn)的主要方法。目的病毒經(jīng)成功包裝后感染細(xì)胞，并給予RU486誘導(dǎo)可觀測(cè)到明顯的熒光表達(dá)，表明

5、系統(tǒng)構(gòu)建成功。進(jìn)一步對(duì)該系統(tǒng)的誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑量進(jìn)行初步研究，結(jié)果表明該系統(tǒng)具有明顯的誘導(dǎo)劑量效應(yīng)，并且靈敏性強(qiáng)。通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析得到最佳的誘導(dǎo)劑量為100nM，然而即時(shí)在該劑量下，系統(tǒng)的誘導(dǎo)效率也只能達(dá)10倍左右。相對(duì)較低的誘導(dǎo)效率可能與感染使用的病毒量不足以及本底表達(dá)水平相對(duì)較高有關(guān)。因此，進(jìn)一步提高病毒產(chǎn)量并降低本底表達(dá)水平仍然是以后工作的重點(diǎn)。
　　 綜上所述，本文成功構(gòu)建了RU486可誘導(dǎo)調(diào)控慢病毒載體系統(tǒng)，