小鼠胚胎干細(xì)胞體外建系及電轉(zhuǎn)染K14-EGFP基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 目前，皮膚缺損是臨床上經(jīng)常遇到的問(wèn)題，應(yīng)用組織工程方法構(gòu)建人工皮膚并應(yīng)用于臨床是研究的熱點(diǎn)。在組織工程化皮膚的研究中，需要能快速大量擴(kuò)增、長(zhǎng)期體外傳代培養(yǎng)、細(xì)胞功能旺盛的種子細(xì)胞。由于胚胎干細(xì)胞(Embrvonic stem cells，ESC)有很高的再生及多向分化的潛能，以胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的皮膚細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化皮膚是一種很好的研究方法，而目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為皮膚細(xì)胞的深入研究并不多

2、。 目的： 本實(shí)驗(yàn)旨在研究和建立帶有角蛋白10-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白fKeratin14-Enhanced Green Fluorescence Protein，K14-EGFP)基因的小鼠胚胎干細(xì)胞系并進(jìn)行鑒定，為組織工程化皮膚的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 方法： 首先體外建系129/S1小鼠的胚胎干細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶染色(Alkaline Phosphatase,AKP)、階段特

3、異性胚胎表面抗原-1(Stage-specific embryonic surface antigen 1，SSEA-1)免疫組染色、體內(nèi)及體外分化實(shí)驗(yàn)等的鑒定分析，證明其胚胎干細(xì)胞的特性，再對(duì)建系成功的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行K14-EGFP基因電轉(zhuǎn)染，并對(duì)轉(zhuǎn)染成功的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行鑒定包括體內(nèi)外向分化能力鑒定。 結(jié)果： 一.成功建立兩株129/S1小鼠的胚胎干細(xì)胞系，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶染色、階段特異性表面抗原-1、體內(nèi)及

4、體外分化實(shí)驗(yàn)等的指標(biāo)鑒定。 二.對(duì)建系成功的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行K14-EGFP(抗G418)電轉(zhuǎn)染，經(jīng)G418篩選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行體外擴(kuò)增，獲得大量帶有K14-EGFP基因片段的小鼠胚胎干細(xì)胞。 結(jié)論： 一.利用生長(zhǎng)3.5天的小鼠囊胚分離培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，并且在建系培養(yǎng)過(guò)程中需應(yīng)用MEF制備的飼養(yǎng)層和白血病抑制因子來(lái)促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的增殖和抑制其分化； 二.胚胎干細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染效率很低，但是轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增可