浮游生物傳播對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）的研究.pdf

1、本文研究的目的就是檢驗(yàn)浮游生物是否可以成為對(duì)蝦白斑綜合癥的傳播媒介并研究其傳播機(jī)制。 以對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中常見的湛江等鞭金藻(Isochrysis zhanjiangensis)、亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、鹽藻(Dunaliella salina)和中肋骨條藻(Skeletonema costatum)四種浮游微藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在與病毒粗提液混合后0．5、1、2、4、8、12、24、48、72、

2、96、120、144、168h采樣，每個(gè)實(shí)驗(yàn)三個(gè)重復(fù)，研究其對(duì)WSSV的攜帶和傳播。研究結(jié)果表明，這四種微藻和WSSV病毒粗提液混合后，經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在混合后96 h內(nèi)微藻都可以攜帶WSSV，其中湛江等鞭金藻和亞心形扁藻在144 h內(nèi)為WSSV陽(yáng)性，鹽藻在120 h內(nèi)為陽(yáng)性，然后在不同時(shí)間之后呈現(xiàn)WSSV陰性，這說(shuō)明浮游微藻可以攜帶WSSV。 通過(guò)病毒—浮游微藻吸附法對(duì)對(duì)蝦池塘中三種常見浮游動(dòng)物——壺狀臂尾輪蟲．Brachi

3、onus urceus、克氏紡錘水蚤Acartia clausi和黑褐新糠蝦Neomysisawatschensis進(jìn)行了WSSV的感染實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照、浸泡法和病毒—浮游微藻吸附法攻毒組三個(gè)處理，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。套式PCR檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組和浸泡法攻毒組中的三種浮游動(dòng)物均為病毒陰性，而病毒—浮游微藻吸附法則使WSSV成功感染這些浮游動(dòng)物，攻毒組中三個(gè)重復(fù)的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，從而找到了一種新的浮游動(dòng)物感染W(wǎng)SSV的方法；同時(shí)表明，微

4、藻可以傳播WSSV。 采用病毒一浮游微藻吸附法使WSSV感染壺狀臂尾輪蟲，然后刺激其產(chǎn)生休眠卵，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，套式PCR檢測(cè)結(jié)果表明，輪蟲的休眠卵和由此孵化出的幼體也為WSSV陽(yáng)性，這表明，輪蟲可以通過(guò)水平和垂直兩種途徑感染上WSSV。用WSSV陽(yáng)性的輪蟲投喂中國(guó)明對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis第Ⅲ期蚤狀幼體(ZⅢ)，每個(gè)處理十個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)表明，雖然幼體沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重死亡，對(duì)照組的死亡率(34.67±15

5、.11％)和攻毒組(39.47±15.44％)差異性也不顯著(P>0.05)；但是幼體的生長(zhǎng)和變態(tài)卻受到很大的影響，變態(tài)率(19.26士5.4％)與對(duì)照組(74.22±10.18％)相比差異顯著(P<0.01)。經(jīng)套式PCR檢測(cè)表明，攻毒組中40％的對(duì)蝦幼體為WSSV陽(yáng)性，而對(duì)照組全為陰性。由此證明，輪蟲可以成為WSSV傳播中的媒介。通過(guò)套式PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，環(huán)膠州灣對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘底泥分離出的150份橈足類休眠卵中14.67％為WSSV陽(yáng)性

6、。由這些休眠卵孵化而來(lái)的幼體中6％為病毒陽(yáng)性，但是，從WSSV陽(yáng)性休眠卵孵化而來(lái)的幼體病毒陽(yáng)性率卻高達(dá)36.37％。運(yùn)用病毒一浮游微藻吸附法對(duì)橈足類的哲水蚤類Acartia sp.進(jìn)行WSSV攻毒實(shí)驗(yàn)，套式PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒組三個(gè)重復(fù)中的哲水蚤均為WSSV陽(yáng)性，其所產(chǎn)的休眠卵以及由此孵化而來(lái)的哲水蚤幼體也為病毒陽(yáng)性，而對(duì)照組中的哲水蚤成體、休眠卵和幼體均為陰性。這表明，橈足類也可以通過(guò)水平和垂直兩種途徑感染W(wǎng)SSV。 通過(guò)

7、病毒-浮游微藻吸附法使橈足類美麗猛水蚤Nitocra sp.感染上WSSV，然后用這些病毒陽(yáng)性猛水蚤投喂日本囊對(duì)蝦Marsupenaeus japonicus的仔蝦，每個(gè)處理四個(gè)重復(fù)，經(jīng)過(guò)15天的投喂，攻毒組(PCO)仔蝦的感染率是100％，死亡率是52.50±5.00％，投喂WSSV陰性猛水蚤對(duì)照組(NCO)的死亡率是20.00士0.00％，兩組相比差異顯著(P<0.05)。為了確認(rèn)WSSV陽(yáng)性猛水蚤體內(nèi)病毒的感染性，本實(shí)驗(yàn)還用病毒陽(yáng)

8、性猛水蚤的組織粗提液注射日本囊對(duì)蝦稚蝦，每個(gè)處理四個(gè)重復(fù)，攻毒20天后，對(duì)蝦的死亡率是72.50±9.57％；一步.PCR檢測(cè)攻毒組的稚蝦全部為病毒陽(yáng)性，而注射病毒陰性猛水蚤組織粗提液稚蝦的死亡率是22.50±5.00％，顯著低于攻毒組(P<0.05)；并且套式PCR檢測(cè)該組對(duì)蝦為陰性。本研究結(jié)果證明，猛水蚤可以作為WSSV的宿主而保持病毒的感染力，并成為病毒的傳播媒介。 利用病毒-浮游微藻吸附法使不同發(fā)育階段的鹵蟲感染W(wǎng)SSV

9、，運(yùn)用RT-PCR方法，以WSSV囊膜蛋白VP28的特異引物檢測(cè)WSSV陽(yáng)性的不同發(fā)育階段鹵蟲，發(fā)現(xiàn)WSSV沒(méi)有在鹵蟲體內(nèi)復(fù)制，由此推斷，鹵蟲可能只是WSSV的物理攜帶者，不是生物攜帶者或宿主。用感染W(wǎng)SSV的鹵蟲投喂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以檢驗(yàn)鹵蟲傳播WSSV的能力，同時(shí)嘗試了尋找新的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)代替對(duì)蝦仔蝦用于WSSV相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。黑褐新糠蝦Neomysis awatschensis和凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei仔蝦攝食WSS

10、V陽(yáng)性的鹵蟲15天后，經(jīng)套式PCR可以檢測(cè)出均呈現(xiàn)WSSV陽(yáng)性；而攝食WSSV陰性鹵蟲的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呈現(xiàn)WSSV陰性。但是，攝食鹵蟲的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明，鹵蟲作為WSSV的物理攜帶者，可以通過(guò)食物途徑傳播病毒。另外，黑褐新糠蝦和凡納濱對(duì)蝦仔蝦攝食WSSV陽(yáng)性中國(guó)明對(duì)蝦肉糜后，全部死亡，套式PCR結(jié)果也為陽(yáng)性。由此說(shuō)明黑褐新糠蝦是WSSV的一種易感動(dòng)物，可以作為對(duì)蝦仔蝦的替代而用于WSSV的實(shí)驗(yàn)，充當(dāng)實(shí)