豆豉食源性致病菌的快速檢測(cè)體系研究.pdf

1、近年來(lái)，在世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件頻發(fā)，是影響公共健康的重要因素，食品安全問(wèn)題越來(lái)越成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。我國(guó)流行的食源性疾病中，細(xì)菌性食物中毒居首位。因此，食品中病原性細(xì)菌檢測(cè)是食品衛(wèi)生安全檢測(cè)中一個(gè)重要的部分。目前食源性致病菌的檢測(cè)方法主要以傳統(tǒng)微生物學(xué)方法為主，不僅操作繁瑣，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，誤檢率高，效率低，一般需要一周左右才能提交檢測(cè)報(bào)告，而且敏感度、特異性均較低。面對(duì)當(dāng)今食品中存在多種食源性致病菌潛在污染的現(xiàn)狀，目前的檢測(cè)方法顯

2、得十分滯后。因此建立快速、高效、準(zhǔn)確的食源性致病菌的檢測(cè)方法變得越來(lái)越迫切。多重PCR是在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)加入了多對(duì)引物、模板從而實(shí)現(xiàn)了在同一體系中對(duì)多個(gè)目的片段的同時(shí)擴(kuò)增的技術(shù)，克服了常規(guī)方法一次只能擴(kuò)增一個(gè)目的片段的缺點(diǎn)，從而為實(shí)現(xiàn)多種食源性致病菌的快速和同時(shí)檢測(cè)，節(jié)省了成本和時(shí)間，多重 PCR檢測(cè)方法有著更為廣闊的發(fā)展空間。
　　通過(guò)檢測(cè)金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，SA）nuc基因、單核增

3、生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）hly A基因、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，PM）ure R基因、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus，BC)hbl A基因、阪崎腸桿菌(Enterobacter sakakii，ES)omp A基因、沙門氏菌（Salmonella，SM） inv A基因的方法，建立一種同時(shí)檢測(cè)六種致病菌的多重PCR體系，以細(xì)菌性豆豉為研究材料，提取樣品宏基因

4、組，設(shè)計(jì)并篩選多對(duì)特異性引物，擴(kuò)增的目的基因片段長(zhǎng)度分別為182 bp、270 bp、376 bp、500 bp、682 bp、867 bp。采用多重 PCR反應(yīng)的預(yù)混液，通過(guò)正交分析方法對(duì)六對(duì)引物進(jìn)行濃度檢測(cè)以確定最佳的反應(yīng)體系，最終反應(yīng)體系為50ul。通過(guò)將六種致病菌模板兩兩隨機(jī)混合檢測(cè)特異性，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所涉及的六種致病菌均有清晰、特異的目標(biāo)條帶，而且本研究所建立的檢測(cè)六種病原菌的多重體系的靈敏度較高，SA的靈敏度為4.3×103

5、CFU/mL，LM靈敏度為2.4×102 CFU/mL， PM靈敏度為6.1×102CFU/mL，BC的靈敏度為6.4×102 CFU/mL，ES靈敏度為：3.1×102 CFU/ mL，SM的靈敏度為5.0×102 CFU/mL。對(duì)貴州不同地區(qū)的48份豆豉樣品進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，采用多重方法簡(jiǎn)單快速且靈敏度高，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間在5h以內(nèi)，這些特點(diǎn)相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法無(wú)論是在特異性，靈敏度方面均有很大提高。
　　實(shí)際樣品檢測(cè)

6、發(fā)現(xiàn)，貴州各地區(qū)豆豉中的食源性致病菌主要有PM、BC和ES，但不同地區(qū)或相同地區(qū)的不同樣品中所含的致病菌種類也不相同。豆豉前發(fā)酵過(guò)程中致病菌的動(dòng)態(tài)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵豆豉與純種強(qiáng)化發(fā)酵豆豉中LM和ES在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中含量基本不變，推測(cè)可能是大豆原料中含有的已滅活的菌體。而PM和BC在發(fā)酵過(guò)程中的變化趨勢(shì)較大。
　　應(yīng)用熒光定量法對(duì)奇異變形桿菌和阪崎腸桿菌的研究顯示，奇異變形桿菌的檢測(cè)靈敏度為85.8 fg/uL，標(biāo)準(zhǔn)曲線E為105.