PK--15細胞α干擾素效應因子檢測方法建立及在JAK--STAT信號通路機制探討中的應用.pdf

1、Theestablishmentandpreliminary001icationofrealtimefl『1；centaOOlicationarealtiefluorescentquantitativePCRassayfordetectingQ—interferoneffectfactorofPK一15cellsThesissubmittedtogngDaoAgriculturalUniversityInFulfillmentofthe

2、RequirementfortheDegreeofMasterofAgronomyZouRongkai(DepartmentofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：ProfessorWangJinbaoQingdaoChinaPK一15細胞Q干擾素效應因子檢測方法建立及在JAKSTAT信號通路機制探討中的應用摘要豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)在病毒學分類上屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。PC

3、V2是一種無囊膜、單股環(huán)狀DNA病毒，能夠引起斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。許多病毒及其蛋白能夠調(diào)控感染細胞內(nèi)的相應信號途徑，還可以影響aIFN信號轉(zhuǎn)導，這可能是病毒感染和對et[FN無應答的重要機制之一，但是PCV2通過JAKSTAT信號通路抑制機體旺IFN產(chǎn)生的機制未見深入研究，因此研究PCV2通過JAKSTAT信號通路抑制機體0【IFN產(chǎn)生的機制顯得尤為重要。本研究的第一部分根據(jù)GenBank中豬的

4、Mxl、OAS和13actin等基因的基因序列，利用分子生物學軟件Premier50在其保守區(qū)設計并合成了相應的特異性引物。利用TRIzol法提取PK15細胞總RNA，經(jīng)Oligod(T)15進行反轉(zhuǎn)錄，利用合成的引物PCR擴增各段目的基因，并克隆至pMDt8T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，以鑒定為陽性的重組質(zhì)粒作為標準品模板建立SYBRGreenI熒光定量RTPCR標準曲線和溶解曲線，并進行敏感性、特異性和重復性試驗。對建立的PK15細

5、胞I型干擾素(0【IFN)效應因子SYBRGreenI實時熒光定量RTPCR方法進行分析，結果表明，所建立的aIFN效應因子SYBRGreenI熒光定量RTPCR檢測方法靈敏度高、特異性強，重復性好，且該方法測得的目的基因、Mxl、OAS和內(nèi)參[3actin標準品基因的cp值與標準品稀釋度在l1011108copies／uL的范圍內(nèi)分別呈良好的線性關系，可以用于檢測PCV2蛋白對I型干擾(o【IFN)素效應因子影響的試驗中。本研究的第二

6、部分中，在生長狀態(tài)良好的單層PK15細胞上接種PCV2，在此基礎上摸索出干擾素的適合添加濃度為750U／mL和最佳作用時間為12小時，在以未做任何處理的PK15細胞和僅被GtIFN處理的PK15細胞作為對照的情況下，研究了PK15細胞在接種PCV2，并受到(1IFN刺激后Mxl、OAS的相對表達量變化情況。結果表明，PK15細胞在接種PCV2，并受到a—IFN刺激后Mxl、OAS的相對表達量較僅被ctIFN處理的PK15細胞明顯降低，但