SYBR Green實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)與間日瘧原蟲(chóng)方法的建立.pdf

1、目的:建立一種檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)的SYBR Green實(shí)時(shí)PCR法，并將建立的方法進(jìn)行初步臨床應(yīng)用。
　　方法:1.針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)與間日瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因設(shè)計(jì)2對(duì)（3條）外引物和2對(duì)（3條）內(nèi)引物，建立可同時(shí)擴(kuò)增出惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)特異性片段的多重巢式PCR方法，并進(jìn)行敏感性、特異性評(píng)價(jià)和臨床標(biāo)本檢測(cè)。2.利用上述巢式引物進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行熔解曲線(xiàn)和Tm值分析。優(yōu)化實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)

2、體系與反應(yīng)條件，檢測(cè)該方法的敏感性、特異性和重復(fù)性并進(jìn)行臨床標(biāo)本檢測(cè)。
　　結(jié)果:1.多重巢式PCR可同時(shí)擴(kuò)增出惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)的18S rRNA基因片段長(zhǎng)度分別為162bp（惡性瘧原蟲(chóng)），112bp(間日瘧原蟲(chóng))，并能檢出混合感染，該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)間日瘧原蟲(chóng)的靈敏度為101copies/μl。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每對(duì)引物只檢測(cè)對(duì)應(yīng)的蟲(chóng)種，54份臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與鏡檢法無(wú)差別(P＞0.05)，敏感度為97.30％，特異度為5.88

3、％。2.SYBR Green實(shí)時(shí)PCR構(gòu)建的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)循環(huán)閾值與模板濃度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，擴(kuò)增效率為101.884％，檢測(cè)靈敏度為101copies/μl，從提取DNA到完成檢測(cè)只需3小時(shí)，重復(fù)性好。該方法與三日瘧原蟲(chóng)及卵形瘧原蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng)，對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與多重巢式PCR檢測(cè)結(jié)果一致。
　　結(jié)論:1.本研究建立的多重巢式PCR方法可同時(shí)檢測(cè)惡性瘧原蟲(chóng)與間日瘧原蟲(chóng)，敏感性高，特異性強(qiáng)，可用于基層部門(mén)對(duì)瘧疾的檢測(cè)與惡性瘧