白黎蘆醇上調(diào)人肺泡上皮細胞SIRT1表達抑制高氧誘導的細胞凋亡.pdf

1、目的:探討去乙?；?(SIRT1)氧化應激通路介導高氧誘導肺泡上皮細胞（HPAEpiC細胞）凋亡的作用，探討其激動劑白藜蘆醇(Res)對高氧誘導肺泡上皮細凋亡的保護作用。
　　方法:將體外培養(yǎng)的人肺泡上皮細胞HPAEpiC株作為研究對象。首先采用MTT法找出最佳Res藥物作用濃度，再將HPAEpiC細胞隨機分為三組:對照組、高氧組、Res組。對照組:在含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng);高氧組:細胞第一

2、次換上述培養(yǎng)液時后，通入3L/min的含95％氧氣的高純混合氣，10～15min后置于50ml/LCO2培養(yǎng)箱密閉中培養(yǎng);Res組:第一次換液時用終濃度為100μmol/L的等量SIRT1誘導劑Res培養(yǎng)，隨后通入3L/min的含95％氧氣的高純混合氣，10～15min后置于50ml/LCO2培養(yǎng)箱密閉中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后檢測以下指標:倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學改變并照相;采用SP細胞免疫組織化學方法檢測細胞內(nèi)caspase-9/

3、XIAP/SIRT1蛋白的表達，激光共聚焦顯微鏡檢測細胞線粒體內(nèi)活性氧簇及其膜電位的變化，Western blot檢測細胞SIRT1蛋白的表達，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率變化。
　　結(jié)果:(1) MTT法提示，最佳Res藥物濃度為100μmol/L。(2)倒置相差顯微鏡下，對照組細胞生長狀態(tài)佳，貼壁率高，細胞活力好，呈扁平不規(guī)則多角形，圓形核位于細胞中央，約占1/3～1/2，細胞數(shù)量多、排列緊密、連接成片，懸浮細胞很少。高氧組細胞生

4、長狀態(tài)差，貼壁率低，細胞活力差，橢圓形或圓形細胞多，細胞間隙增大，連接松散，活細胞數(shù)量明顯減少，懸浮細胞數(shù)量明顯增多。Res組細胞生長狀態(tài)、貼壁、細胞活力欠佳，活細胞細胞數(shù)量較高氧組有所增加、懸浮細胞數(shù)較高氧組減少，但未達對照組水平。與進口一次性塑料培養(yǎng)瓶比較，HPAEpiC細胞在國產(chǎn)玻璃培養(yǎng)瓶中生長狀態(tài)佳，在一次性培養(yǎng)瓶中不能存活。(3)免疫組化結(jié)果顯示:與對照組相比，高氧組24h后HPAEpiC細胞的caspase-9/XIAP/S

5、IRT1表達差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與高氧組相比，Res組24h后HPAEpiC細胞的caspase-9/XIAP/SIRT1表達差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(4)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:線粒體內(nèi)活性氧顯示紅色熒光，細胞核顯示藍色熒光。對照組活性氧表達最低，高氧組活性氧表達最高，Res組介于兩者之間，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(5)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示:與對照組相比，高氧組細胞線粒體膜電位（△Ψm）明顯

6、下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;與高氧組相比，Res組△Ψm有所升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但未達到對照組水平(P＜0.05)。(6) Western blot結(jié)果顯示:與對照組相比，高氧組細胞SIRT1蛋白表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，Res組與對照組相比，細胞內(nèi)SIRT1蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(7)流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:高氧組與對照組相比，細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)