間斷性牽張力經(jīng)由p38MAPK-osterix信號通路促進(jìn)小鼠BMSCs成骨向分化.pdf

1、目的:機(jī)械牽張應(yīng)力刺激BMSCs成骨分化是牽張成骨、正畸牙移動以及骨折愈合過程中新骨生成的關(guān)鍵細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。BMSCs是一類具有多向分化潛能的干細(xì)胞，也是對機(jī)械應(yīng)力最敏感細(xì)胞之一。既往研究已證實(shí)牽張力可以誘導(dǎo)BMSCs成骨向分化。p38MAPK信號通路在炎癥反應(yīng)，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞分化等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用，既往研究也發(fā)現(xiàn)p38MAPK與間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化關(guān)系密切。osterix是一種含鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞特異表達(dá)，是成骨分化和骨

2、生成的關(guān)鍵因素。研究表明機(jī)械力刺激可誘導(dǎo)osterix高表達(dá)。然而，目前有關(guān)p38MAPK信號通路和osterix與機(jī)械牽張力促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化的關(guān)系以及二者間相互關(guān)系的研究，國內(nèi)外尚未見有報道。本研究擬以小鼠BMSCs為研究對象，配合多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)，構(gòu)建小鼠BMSCs體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型、 Osterix基因沉默BMSCs模型。研究p38MAPK信號通路和Osterix與機(jī)械牽張力促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化的關(guān)系

3、以及二者間的相互關(guān)系。我們的研究為細(xì)胞生物力學(xué)刺激成骨方面的機(jī)制提供了參考，可以根據(jù)其發(fā)展趨勢做進(jìn)一步研究，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　方法:BMSCs原代培養(yǎng):無菌下剝離C57BL/6J近交系小鼠雙側(cè)股骨和脛骨，應(yīng)用全骨髓法進(jìn)行原代BMSCs體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、多向誘導(dǎo)分化及流式細(xì)胞表面分子鑒定。以體外原代培養(yǎng)的BMSCs為研究對象，通過成功構(gòu)建BMSCs體外培養(yǎng)-力學(xué)刺激模型，使用多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載

4、系統(tǒng)對BMSCs加載力學(xué)刺激。將C57BL/6J小鼠BMSCs分為空白對照組、牽張力組和牽張力阻斷組（SB203580（一種p38MAPK通路抑制劑）+牽張力），采用多通道細(xì)胞牽張應(yīng)力加載系統(tǒng)，施加頻率為0.5Hz，振幅為0.8％的牽張力，每天2次，每次30min，分別在實(shí)驗(yàn)第1、3、5天收獲BMSCs細(xì)胞。間斷性牽張力作用后，Real time-PCR檢測成骨基因ALP、COLI、OCN及Osterix的mRNA表達(dá)變化情況，West

5、ern blotting檢測及Osterix蛋白和P-p38MAPK蛋白的表達(dá)情況。用SB203580抑制P38MAPK信號通路后， Western blotting檢測及Osterix蛋白和P-p38MAPK蛋白的表達(dá)情況，Realtime-PCR檢測成骨基因ALP、COLI、OCN及Osterix的mRNA表達(dá)變化情況。通過siRNA技術(shù)沉默小鼠BMSCs的Osterix基因，Western blotting檢測Osterix蛋白的

6、表達(dá)情況，Real time-PCR檢測成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN mRNA的表達(dá)量變化情況。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.C57BL/6J小鼠BMSCs傳代后細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定，呈梭形;流式細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示第2代BMSCs細(xì)胞均一性在90％以上，CD11b、CD34、CD45陰性細(xì)胞比例分別為5.87％、0.43％、4.43％; CD44、CD105、Sca-1陽性細(xì)胞

7、比例分別為99.67％、99.80％、99.81％。成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色可觀察到礦化結(jié)節(jié)，成脂誘導(dǎo)后油紅0染色細(xì)胞內(nèi)可見紅色脂滴。
　　2.牽張力作用后，可觀察到成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN及Osterix mRNA表達(dá)水平增高，同一時間點(diǎn)，牽張力組上述基因與對照組相應(yīng)基因相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05或**P＜0.01）。Western blotting結(jié)果顯示，牽張力組Osterix蛋白和P-p38MAPK的

8、蛋白水平明顯升高，同一時間點(diǎn)，牽張力組Osterix蛋白和P-p38MAPK的蛋白水平與對照組相應(yīng)蛋白表達(dá)水平相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05或**P＜0.01）。
　　3.SB203580抑制P38MAPK信號通路后，小鼠BMSCs成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN和Osterix mRNA的表達(dá)量降低，Western blotting結(jié)果也顯示相似的結(jié)果，同一時間點(diǎn)，阻斷組上述基因、蛋白表達(dá)水平與牽張力組相應(yīng)基因和蛋白

9、表達(dá)水平相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05或**P＜0.01）。
　　4.沉默Osterix后，小鼠BMSCs成骨相關(guān)基因ALP、COLI、OCN mRNA的表達(dá)水平也隨之降低，同一時間點(diǎn)，牽張力對照組上述基因與牽張力-siRNA組相應(yīng)基因相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05或**P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.間斷性牽張力可促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化。
　　2.p38MAPK-Osterix通路在這