鼠腦血腫周圍細(xì)胞凋亡與神經(jīng)干細(xì)胞增殖及胞磷膽堿鈉治療的研究.pdf

1、人類腦內(nèi)出血占卒中病人的10％-15％，死亡人數(shù)約占卒中死亡者的50％。88％的存活者遺留不同程度神經(jīng)功能障礙。神經(jīng)功能障礙由出血造成的腦組織破壞、受壓、腦水腫以及腦血流再灌注等引起。其引發(fā)的病理生理變化復(fù)雜多樣。隨著缺血性腦損傷的基礎(chǔ)研究的進(jìn)展，腦梗死患者的預(yù)后有了一定改觀，而占住院腦血管病患者近半數(shù)的高血壓性腦出血(HICH)患者的病死率及致殘率仍較高，其主要原因：①既往對(duì)腦出血的治療主要針對(duì)血腫本身，治療效果還欠理想，②與缺血性腦

2、損傷的基礎(chǔ)研究相比，人們對(duì)腦出血后的病理生理過(guò)程、尤其對(duì)血腫周圍組織(PHT)細(xì)胞損傷的原因、轉(zhuǎn)歸及保護(hù)的研究還有待于進(jìn)一步深入。所以，建立一種制作過(guò)程創(chuàng)傷小、血腫形成穩(wěn)定、腦出血病理生理變化接近臨床患者表現(xiàn)的動(dòng)物模型顯得尤為重要；很有必要從現(xiàn)代神經(jīng)病理生理角度對(duì)腦內(nèi)血腫周圍組織進(jìn)行細(xì)致研究，如從細(xì)胞凋亡、神經(jīng)干細(xì)胞等方面入手進(jìn)行研究；同時(shí)選擇有效、費(fèi)用適合廣大城鄉(xiāng)居民經(jīng)濟(jì)承受能力的神經(jīng)保護(hù)劑也是一項(xiàng)有益的工作，本實(shí)驗(yàn)對(duì)腦出血后早期使用

3、胞磷膽堿鈉進(jìn)行了嘗試性的研究。 研究目的： 1.探討腦出血后血腫周圍區(qū)細(xì)胞凋亡的時(shí)間規(guī)律性。 2.探討腦出血后血腫周圍區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況。 3.探討外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植后，其在腦內(nèi)血腫周圍區(qū)增殖的規(guī)律，同時(shí)驗(yàn)證從新生幼鼠腦組織內(nèi)可分離并培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞。 4.探討腦出血后早期使用胞磷膽堿鈉在動(dòng)物模型治療中的可行性，從而為臨床早期使用胞磷膽堿鈉治療腦出血、保護(hù)受損神經(jīng)組織細(xì)胞提供可行性依據(jù)

4、，同時(shí)從腦內(nèi)血腫周圍區(qū)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)干細(xì)胞增殖等層面討論胞磷膽堿鈉對(duì)出血性腦損傷的作用機(jī)制。 研究技術(shù)路線：1.建立SD大鼠腦內(nèi)出血模型，取自體非抗凝尾動(dòng)脈血注入大鼠右側(cè)尾殼核制作腦出血模型，不同時(shí)間對(duì)模型進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)行為學(xué)評(píng)分、測(cè)定腦組織含水量并觀察腦組織病理變化，證明該動(dòng)物模型適于腦內(nèi)血腫的病理生理基礎(chǔ)研究。 2.對(duì)制作成功的腦出血模型進(jìn)行研究，分為給藥組與對(duì)照組，前者給予胞磷膽堿鈉注射液，后者于相同時(shí)間點(diǎn)給予相同劑

5、量的生理鹽水，模型制作后清醒時(shí)腹腔第一次給藥，以后每24h給藥一次，處死前6h最后一次給藥；不同時(shí)間取腦標(biāo)本，10倍手術(shù)顯微鏡下毫米刻度尺測(cè)量血腫截面積大小，而后依多田公式估算血腫體積；流式細(xì)胞儀檢測(cè)血腫周圍區(qū)細(xì)胞凋亡率，WestonBlot檢測(cè)bcl-2的蛋白水平表達(dá)。 3.腦內(nèi)出血模型分成胞磷膽堿鈉組(對(duì)照組)和生理鹽水組(給藥組)，于出血后不同時(shí)間(48h、72h、7d、14d、28d)用4％多聚甲醛灌注動(dòng)物取腦標(biāo)本，灌注

6、前1d每組隨機(jī)取三只大鼠腹腔注射BrdU注射液；用免疫組化法檢測(cè)血腫周圍尾殼核區(qū)Nestin與BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。 4.取乳鼠腦組織分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞；細(xì)胞免疫組化法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞；血腫周圍多點(diǎn)注射法移植神經(jīng)干細(xì)胞；神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分法、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(PET)測(cè)血腫周圍腦組織代謝等方法衡量神經(jīng)干細(xì)胞移植后治療效果。 5.用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 研究結(jié)果：

7、 1.實(shí)驗(yàn)中制作的腦出血模型適于腦內(nèi)血腫的病理生理等基礎(chǔ)研究；模型制作成功后，大鼠腦出血后6h出現(xiàn)行為異常，28d行為異常好轉(zhuǎn)；腦含水量24h增加(P＜0.05)，48h-72h達(dá)高峰(P＜0.01)；7d血腫開始吸收，28d血腫大部分吸收；鏡下，血腫側(cè)早期腦室受壓、細(xì)胞腫脹，晚期膠質(zhì)增生。 2.大鼠腦內(nèi)出血后血腫周圍區(qū)6h出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，72h達(dá)高峰，7d時(shí)仍有一定量的維持，可持續(xù)28d。對(duì)應(yīng)的胞磷膽堿鈉組與生理鹽水組大

8、鼠腦內(nèi)血腫大小于同一時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)顯著差異；除6h與28d外，余各時(shí)間點(diǎn)均顯示給藥組細(xì)胞凋亡率低于對(duì)照組，尤以72h組為甚(P＜0.01)，bcl-2的表達(dá)高于對(duì)照組。 3.腦出血后48h始在血腫周圍區(qū)有Nestin和BrdU陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，72h、7d逐漸增多，14d達(dá)高峰(P＜0.01)，28d細(xì)胞已開始變的稀疏(P＜0.05)。除48h、28d外，胞磷膽堿鈉組血腫周圍陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比非治療組相對(duì)增多(P＜0.05)，但出現(xiàn)的時(shí)間與

9、峰值到達(dá)的時(shí)間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。 4.移植組神經(jīng)系統(tǒng)評(píng)分與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05)，移植組血腫周圍組織代謝高于對(duì)照組(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.此腦出血?jiǎng)游锬Ｐ椭谱鞣奖恪?chuàng)傷小、血腫形成穩(wěn)定，腦出血病理生理變化接近臨床患者表現(xiàn)。 2.腦出血后血腫周圍腦組織發(fā)生細(xì)胞凋亡且有時(shí)間規(guī)律性；胞磷膽堿鈉早期治療實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血不引起血腫擴(kuò)大且可減低血腫周圍細(xì)胞凋亡率；減少血腫周圍區(qū)細(xì)胞凋

10、亡可能是胞磷膽堿鈉對(duì)腦出血治療作用的機(jī)制之一，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該治療作用可能是胞磷膽堿鈉通過(guò)維持血腫周圍組織細(xì)胞bcl-2的蛋白表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 3.自體非抗凝動(dòng)脈血致大鼠腦出血后，在一定時(shí)間內(nèi)，前腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞可在血腫周圍區(qū)出現(xiàn)且增殖，胞磷膽堿鈉的治療有利于內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。 4.同種異體神經(jīng)干細(xì)胞移植在大鼠腦內(nèi)血腫周圍區(qū)，能夠改善腦代謝但不能明顯改善神經(jīng)功能缺失癥狀。 創(chuàng)新性： 1.在以往研