MicroRNAs在骨肉瘤耐藥中的作用及分子機制.pdf

1、研究背景：
　　骨肉瘤是一類好發(fā)于青少年具有高度惡性的骨腫瘤。骨肉瘤具有高轉(zhuǎn)移性，最易轉(zhuǎn)移的器官是肺。在沒有化療的時代，超過85％的截肢后患者發(fā)生了轉(zhuǎn)移。隨著新輔助化療的提出，結合保肢技術的發(fā)展，目前對于骨肉瘤治療的5年生存率可以提高到60%左右。雖然化療在骨肉瘤治療中發(fā)揮了重要作用，但是該方法總體有效率為60%左右。目前骨肉瘤新輔助化療的藥物為順鉑（CDDP），阿霉素（ADM），甲氨蝶呤（MTX）和異環(huán)磷酰胺（IFO）。順鉑是目

2、前廣泛應用抗腫瘤藥物之一。伴隨著治療過程的延長，越來越多的患者發(fā)展為對于化療的耐藥，甚至多藥耐藥，導致治療的失敗。順鉑耐藥已經(jīng)成為骨肉瘤治療過程中的一個非常棘手的問題。耐藥產(chǎn)生的機制十分復雜，至今仍未完全闡明。近年來，隨著miRN A的發(fā)現(xiàn)，大量的研究證明這類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可以調(diào)控超過30％的人類的基因轉(zhuǎn)錄后表達，從而廣泛參與細胞的各種信號途徑。同樣，有研究表明耐藥機制發(fā)生發(fā)展過程中的一些相關蛋白表達也受 miRN A的調(diào)控

3、，因此探尋這種上游調(diào)控機制，研究 miRN A分子不僅可確定骨肉瘤的一種生物標志物，而且還可以作為骨肉瘤治療的靶點。
　　目的：
　　建立一種骨肉瘤細胞多藥耐藥模型，篩選與骨肉瘤耐藥相關的 miRN A分子，研究miRN A參與骨肉瘤耐藥的分子機制。為臨床治療骨肉瘤耐藥提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.在體外采用逐步增加劑量沖擊誘導的方法建立人骨肉瘤耐藥細胞系，SOSP-9607/CDDP。
　　2

4、.采用形態(tài)學方法，測定生長曲線計算耐藥細胞系倍增時間，MTT方法檢測細胞對于化療藥物的耐藥性，Tra nswe ll實驗檢測細胞的侵襲能力，流式細胞儀技術檢測細胞周期，RT-PCR技術檢測耐藥相關基因mRNA的表達，免疫細胞化學和western blot方法檢測 MRP1的表達，從而分析耐藥細胞系SOSP-9607/CDDP的生物學特性。
　　3.采用Affymetrix miRNA2.0芯片篩選耐藥細胞SOSP-9607/CDD

5、P和親本細胞SOSP-9607中miRNA表達譜的差異。
　　4.采用熒光實時定量 PCR技術驗證芯片篩選出的耐藥細胞 SOSP-9607/CDDP和親本細胞SOSP-9607中差異表達的5個microRNAs。
　　5.運用生物信息學方法分析芯片結果，預測參與骨肉瘤細胞耐藥的靶基因，發(fā)現(xiàn)BAK1的3’-UTR和miR-25的種子序列存在結合位點。
　　6.使用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將 miR-25轉(zhuǎn)染入骨肉瘤親本細胞 SOS

6、P-9607上調(diào)miR-25的表達，將 anti-miR-25轉(zhuǎn)染入耐藥細胞 SOSP-9607/CDDP下調(diào)miR-25的表達。
　　7.采用 RT-PCR、western blot、流式細胞儀檢測細胞凋亡、體外藥物敏感實驗等方法分析轉(zhuǎn)染miRN A分子后骨肉瘤細胞功能改變。
　　8.使用pmirGlo-vector熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-25和BAK1的靶向關系。
　　結果：
　　1.歷時12個月誘導建立

7、骨肉瘤耐藥細胞系 SOSP-9607/CDDP，該細胞系行脫藥培養(yǎng)、反復凍存后耐藥性質(zhì)穩(wěn)定。
　　2.形態(tài)學上，SOSP-9607/CDDP較其親本細胞SOSP-9607發(fā)生改變。生長曲線顯示 SOSP-9607/CDDP較其親本細胞 SOSP-9607倍增時間延長，分別是45.11h與29.79 h。細胞周期結果顯示耐藥細胞SOSP-9607/CDDP在G0/G1期較親本細胞 SOSP-9607增加，在S期較親本細胞 SOSP-

8、9607降低(P<0.05)。兩者在G2/M期無明顯差異。SOSP-9607/CDDP較其親本細胞SOSP-9607對順鉑的耐藥指數(shù)是6.24，同時對CBP，MTX和ADM顯示出交
　　叉耐藥。Transwell分析檢測結果顯示 SOSP-9607/CDDP較親本細胞SOSP-9607的侵襲能力增加。相比較親本細胞 SOSP-9607，MRP1，MRP2和GST-πmRNA的表達在SOSP-9607/CDDP細胞中表達增加（P<0

9、.01）。免疫細胞化學染色顯示 MRP1在耐藥細胞中高表達。we ster n b lo t結果顯示MRP1在耐藥細胞中高表達。
　　3.與骨肉瘤親本細胞系 SOSP-9607相比，骨肉瘤順鉑耐藥細胞系SOSP-9607/CDDP中存在18個差異表達的miRN As分子，其中，包含11個表達上升的miRN As分子（P<0.05）和7個表達下降的miRN As（P<0.05）
　　4.熒光實時定量PCR結果顯示，miR-25

10、，-29c，-1290，-194與芯片檢測的結果相符合。
　　5.生物信息學方法預測結果顯示，BAK1的3’-UTR和miR-25的種子序列存在結合位點。
　　6.轉(zhuǎn)染miR-25后，骨肉瘤實驗組細胞與對照組細胞相比，BAK1 mRNA的表達水平無明顯意義上的差異。在親本細胞中轉(zhuǎn)染 miR-25前體，BAK1蛋白表達水平具有統(tǒng)計學意義的下降（P<0.05）。在耐藥細胞的中轉(zhuǎn)染miR-25抑制劑，BAK1蛋白表達水平具有統(tǒng)計學

11、意義的上升（P<0.05）。
　　7.在親本細胞和耐藥細胞中分別轉(zhuǎn)染 miR-25前體和抑制劑后，親本細胞的抗凋亡能力增加（P<0.05），耐藥細胞抗凋亡能力降低（P<0.05）。
　　8.采用MTT方法檢測轉(zhuǎn)染后的骨肉瘤細胞對于化療藥物的敏感性，結果顯示，在親本細胞中上調(diào) miR-25的表達可增加細胞對于多種化療藥物的半數(shù)致死量，產(chǎn)生耐藥性。在耐藥細胞中下調(diào) miR-25的表達可降低細胞對于多種化療藥物的半數(shù)致死量，從而逆

12、轉(zhuǎn)耐藥性。
　　9.共轉(zhuǎn)染pre-miR-25和pmirGlo-BAK1-3’UTR的骨肉瘤實驗組的熒光素酶活性具有顯著意義的降低（P<0.05），該結果表明 miR-25能夠作用于 BAK1的3’UTR區(qū)域，BAK1為miR-25的靶基因。
　　結論：
　　成功建立了骨肉瘤耐藥細胞系，SOSP-9607/CDDP，實驗證明該細胞系可以作為骨肉瘤耐藥分子機制的研究模型。骨肉瘤耐藥細胞系中存在多個差異表達的miRN As