鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、本試驗(yàn)以梅花鹿二杠茸為研究材料，通過(guò)組織學(xué)解剖，取得鹿茸的間充質(zhì)，經(jīng)過(guò)胰酶消化，培養(yǎng)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞，成功構(gòu)建了鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。用TRIZOL提取鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，長(zhǎng)距離PCR方法合成雙鏈cDNA；PCR產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K水解、純化后，用SfiI酶切；將酶切產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離，回收500bp以上的cDNA組分，并與λTrip1Ex2載體連接；連接產(chǎn)物經(jīng)體外蛋白包裝，產(chǎn)生初級(jí)文庫(kù)；鑒定文庫(kù)的滴度后，進(jìn)行文

2、庫(kù)擴(kuò)增。隨機(jī)挑取若干個(gè)噬菌斑，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的質(zhì)量。經(jīng)測(cè)定該文庫(kù)初始滴度為3.0×105pfu/ml，擴(kuò)增后滴度為6.0×108pfu/ml。插入片段長(zhǎng)度為大于500bp，也有1000bp以上的片斷。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中采用附加序列的方法使全長(zhǎng)mRNA得到反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA是完整的，完全符合cDNA文庫(kù)的要求。 鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)的成功構(gòu)建，為我們釣取鹿茸間充質(zhì)特異基因研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)