瘦素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制研究.pdf

1、背景:肥胖是高血壓、動脈粥樣硬化、心力衰竭等多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。瘦素（Leptin）是ob基因編碼的產(chǎn)物，由脂肪細(xì)胞分泌入血，調(diào)節(jié)食欲和能量代謝。數(shù)項(xiàng)研究顯示在體外瘦素能夠直接作用于原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞肥大。我們之前的研究也證實(shí)在原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞，瘦素能夠刺激內(nèi)皮素-1（Endothelin-1，ET-1）分泌，并通過ET-1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞內(nèi)氧活性物質(zhì)（

2、Reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生。但是，由于ETA 受體拮抗劑ABT-627未能完全阻斷瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和ROS產(chǎn)生，這就提示仍然存在其他通路介導(dǎo)瘦素的作用。
　　 過氧化物酶體增生因子活化受體α（Peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）在線粒體脂肪酸氧化豐富的組織如心臟，肝臟，骨骼肌等呈高水平表達(dá)。PPARα主要影響脂肪酸氧化（Fa

3、tty acid oxidation，F(xiàn)AO）循環(huán)中3個關(guān)鍵步驟所涉及的基因表達(dá)：脂肪酸攝取/酯化，脂肪酸線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)和線粒體β-氧化。最近的研究認(rèn)為，PPARα作為心臟脂肪酸氧化的關(guān)鍵調(diào)控基因，決定了心臟功能障礙發(fā)展過程中的能量底物利用轉(zhuǎn)換。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，由STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型和肥胖db/db小鼠，其心臟PPARα活性均明顯增高；心臟過度表達(dá)PPARα（MHC-PPARα）導(dǎo)致糖尿病樣的心肌肥厚。同時，一些臨床研究也顯示心力衰竭病

4、人心臟脂肪酸攝取增加；終末期舒張性心肌病的病人，其心臟PPARα表達(dá)增高，脂肪酸代謝速率增加。盡管PPARα的外源性配體貝特類藥物作為降血脂藥物在臨床上廣泛應(yīng)用，但根據(jù)FDA的報告，目前已經(jīng)有50多種PPAR激動劑由于其心臟毒性等多種毒性作用而被終止使用。這些研究提示PPARα活化誘導(dǎo)的脂肪酸利用上調(diào)及對糖代謝的抑制作用能夠引起心肌重構(gòu)，造成嚴(yán)重的心肌病。
　　 瘦素，作為PPARα的內(nèi)源性激動劑，在肝臟、脂肪組織等多種細(xì)胞和組

5、織中通過活化PPARα調(diào)節(jié)能量代謝。因此，我們假設(shè)PPARα活化參與了瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。本文用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，第一部分主要探討PPARα活化與心肌細(xì)胞肥大的關(guān)系；第二部分研究PPARα活化在瘦素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用；并從分子水平研究瘦素對PPARα表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及具體機(jī)制，初步探討瘦素對心肌細(xì)胞脂肪酸代謝的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制，從而為心肌肥大的機(jī)制研究提供新的思路和線索。
　　 第一部分 PPARα活

6、化與心肌肥大
　　 目的：探討PPARα活化與心肌細(xì)胞肥大的關(guān)系。
　　 方法：用原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建腺病毒載體Ad-CMV-PPARα上調(diào)PPARα表達(dá)。分別用6.25-100 μmol/L PPARα激動劑非諾貝特和腺病毒載體Ad-CMV-PPARα孵育心肌細(xì)胞，檢測總RNA、胚胎型基因mRNA表達(dá)、蛋白合成速率和心肌細(xì)胞表面積等心肌肥大指標(biāo)；同時用上述干預(yù)因素處理細(xì)胞，ROS敏感的熒光探針DCF

7、-DA檢測心肌細(xì)胞ROS含量的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.PPARα激動劑非諾貝特（6.25-100 μmol/L）能夠濃度依賴性的增加心肌細(xì)胞總RNA含量；上調(diào)心肌細(xì)胞胚胎基因ANF mRNA表達(dá)；增加心肌細(xì)胞蛋白合成速率和心肌細(xì)胞表面積（6.25μmol/L組P>0.05，其余全部P<0.05）；
　　 2.腺病毒載體Ad-CMV-PPARα特異性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞PPARα持續(xù)高表達(dá)，能夠上調(diào)心肌細(xì)胞胚胎基因

8、ANF mRNA表達(dá)；增加細(xì)胞表面積和蛋白合成速率（P<0.05）；
　　 3.PPARα激動劑非諾貝特（6.25-100 μmol/L）能夠濃度依賴性的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞DCF-DA熒光強(qiáng)度增加（6.25μmol/L組P>0.05，其余全部P<0.05）。
　　 小結(jié):
　　 1.心肌細(xì)胞PPARα過度活化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。
　　 2.心肌細(xì)胞PPARα過度活化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生。
　　 第二部分

9、 PPARα活化介導(dǎo)瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大
　　 目的：
　　 1.研究PPARα活化是否介導(dǎo)瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大；
　　 2.探討瘦素對PPARα表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及具體機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.分別用PPARα拮抗劑GW6471（0.01-10 μmol/L）和RNAi方法抑制心肌細(xì)胞PPARα表達(dá)。GW6471（0.01-10 μmol/L）與瘦素（100 ng/mL）共同孵育細(xì)胞72小

10、時，檢測總RNA、總蛋白、胚胎型基因mRNA表達(dá)、蛋白合成速率和心肌細(xì)胞表面積等心肌肥大指標(biāo)變化；PPARαsiRNA轉(zhuǎn)染后再加入瘦素（100 ng/mL）孵育細(xì)胞48小時，檢測胚胎型基因ANF mRNA表達(dá)、蛋白合成速率和心肌細(xì)胞表面積等心肌肥大指標(biāo)變化；
　　 2.GW6471（0.01-10 μmol/L）與瘦素（100 ng/mL）孵育細(xì)胞4小時，用ROS敏感的熒光探針DCF-DA檢測心肌細(xì)胞ROS含量的變化；PPARα

11、siRNA轉(zhuǎn)染后瘦素（100 ng/mL）孵育細(xì)胞4小時，ROS敏感的熒光探針DCF-DA檢測細(xì)胞ROS含量的變化；
　　 3.熒光定量PCR法、Western-blot法檢測1-1000 ng/mL瘦素對心肌細(xì)胞PPARα表達(dá)影響；
　　 4.凝膠遷移電泳試驗(yàn)、DNA-binding ELISA法檢測1-1000 ng/mL瘦素對心肌細(xì)胞PPARα活性影響；
　　 5.熒光定量PCR法檢測瘦素對心肌細(xì)胞脂肪酸代

12、謝酶M-CPT1、ACO、FAS、ACS mRNA表達(dá)和糖代謝酶GLUT-1、GLUT-4、PFK、PDK4 mRNA表達(dá)的影響；Western-blot法檢測瘦素對心肌細(xì)胞AMPKα表達(dá)的影響；
　　 6.Western-blot法檢測AMPK抑制劑Compond C（40 μmol/L）對瘦素誘導(dǎo)PPARα表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.PPARα拮抗劑GW6471（0.01-10 μmol/L）濃度依

13、賴性的抑制瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞總RNA含量、總蛋白含量增加，胚胎型基因ANF mRNA表達(dá)增多，蛋白合成速率、心肌細(xì)胞表面積增加（0.01 μmol/L組P>0.05，其余全部P<0.05）；
　　 2.RNA干擾抑制PPARα表達(dá)能夠抑制瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞胚胎型基因ANF mRNA表達(dá)，抑制蛋白合成速率、心肌細(xì)胞表面積增加（P<0.05）；
　　 3.PPARα拮抗劑GW6471（0.01-10 μmol/L）和PPAR

14、αsiRNA抑制瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)DCF-DA熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（0.01 μmol/L組P>0.05，其余全部P<0.05）；
　　 4.1-1000 ng/mL瘦素濃度依賴性的誘導(dǎo)PPARαmRNA和蛋白表達(dá)增加（P<0.05）；濃度依賴性的上調(diào)PPARα活性（P<0.05）；
　　 5.100 ng/mL瘦素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞脂肪酸代謝酶M-CPT1、ACO、FAS表達(dá)增高（P<0.05），調(diào)節(jié)糖代謝的酶GLUT-1、PFK

15、表達(dá)降低（P<0.05），負(fù)向調(diào)節(jié)糖代謝的酶PDK4表達(dá)升高（P<0.05）；瘦素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞AMPKα、ACC磷酸化；1 μmol/L PPARα拮抗劑GW6471、PPARαsiRNA能夠抑制瘦素對脂肪酸代謝酶mRNA表達(dá)的上調(diào)（P<0.05）；
　　 6.AMPK抑制劑Compond C（40 μmol/L）抑制瘦素誘導(dǎo)的PPARα表達(dá)。
　　 小結(jié)：
　　 1.抑制PPARα表達(dá)能夠抑制瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞

16、肥大和ROS產(chǎn)生；
　　 2.瘦素能夠濃度依賴性的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞PPARα表達(dá)，上調(diào)其活性；
　　 3.初步證實(shí)瘦素能夠活化AMPKα，促進(jìn)心肌細(xì)胞脂肪酸代謝，抑制糖的代謝；
　　 4.瘦素可能通過活化AMPKα調(diào)控PPARα表達(dá)。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.PPARα過度活化誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和ROS產(chǎn)生；
　　 2.PPARα活化介導(dǎo)瘦素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和ROS產(chǎn)生；
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