WSSV-VP28融合蛋白的免疫效果及F0-ATP合酶cDNA的克隆.pdf

1、對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）是對對蝦養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生巨大危害的病毒，目前還未發(fā)現(xiàn)有效的治療措施。為了尋找對該病毒的有效防控方法，本文構(gòu)建了三種含VP28的融合蛋白并研究其對凡納濱對蝦的保護作用，在最后一節(jié)內(nèi)容中，克隆了與WSSV感染過程相關(guān)的F0-ATP合酶序列的全長，以上研究為后續(xù)實驗的開展提供基礎(chǔ)。
　　1.針對VP28C和Hsp70p這兩段目的基因，設(shè)計引物，經(jīng)過PCR擴增分別得到了目的基因，經(jīng)雙酶切和連接反應(yīng)，成功的將這兩個片

2、段克隆至載體pBAD/gⅢA中。通過轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將構(gòu)建的重組載體導(dǎo)入到感受態(tài)細胞Top10中。將大腸桿菌進行大量的培養(yǎng)后，添加一定濃度的誘導(dǎo)劑，使構(gòu)建的融合蛋白在大腸桿菌內(nèi)得到了成功的表達，利用SDS-PAGE和Western-blot對表達的蛋白進行了驗證。通過Co2+親和層析和超濾技術(shù)獲得純化的目的蛋白獲得了濃度較高的純化蛋白。通過肌肉注射的方式將蛋白注射到對蝦體內(nèi)，采用病料投喂方式進行凡納濱對蝦感染，結(jié)果表明，構(gòu)建的融合蛋白對對蝦有

3、一定的保護作用。通過熒光定量實驗，檢測了對蝦體內(nèi)與免疫反應(yīng)相關(guān)的幾種基因的表達量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射蛋白的對蝦組與對照組相比，其免疫相關(guān)的基因SOD、LZM、CAT和STAT的表達量有不同程度的增加，進一步驗證了該蛋白對對蝦的保護作用。
　　2.針對凡納濱對蝦鐵蛋白基因序列，設(shè)計了相應(yīng)的引物，利用PCR技術(shù)，擴增得到了凡納濱對蝦的鐵蛋白基因，經(jīng)過雙酶切和連接反應(yīng)，將鐵蛋白基因和VP28C基因這兩段目的基因成功克隆至pBAD/gⅢ

4、A中。通過轉(zhuǎn)化反應(yīng)，將構(gòu)建好的重組載體成功導(dǎo)入到感受態(tài)細胞大腸桿菌中。測序結(jié)果表明構(gòu)建的重組載體序列完全正確。在將大腸桿菌進行大量培養(yǎng)后，通過加入一定濃度的誘導(dǎo)劑L-Arab，使構(gòu)建的重組載體在大腸桿菌內(nèi)進行了成功的表達。通過Co2+親和層析和超濾技術(shù)，獲得了純度較高的目的蛋白。利用SDS-PAGE和Western-blot對純化獲得的蛋白進行了驗證。在養(yǎng)殖實驗中，通過肌肉注射的方式將該蛋白注射到對蝦的體內(nèi)，在免疫期過后通過給對蝦投喂病

5、料的方式讓對蝦感染 WSSV以研究該蛋白對對蝦的保護作用。統(tǒng)計的累計死亡率實驗結(jié)果表明，與對照組相比該蛋白對對蝦有一定的保護作用并且在病毒感染的前期其保護效果更加明顯。通過熒光定量實驗分析了對蝦體內(nèi)LGBP和LvP38基因的表達量的變化，結(jié)果表明，在注射該蛋白后對蝦體內(nèi)這兩種基因的表達量與對照組相比明顯的增加，這進一步驗證了該蛋白對凡納濱對蝦對蝦的保護作用。
　　3.通過查閱文獻資料，獲得了細胞穿透肽（TAT）的基因序列，通過在線

6、設(shè)計優(yōu)化軟件，對這段序列進行了優(yōu)化和合成，使其更適于在大腸桿菌中表達。通過雙酶切和連接反應(yīng)，構(gòu)建TAT-VP28C重組載體。經(jīng)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將該載體導(dǎo)入到大腸桿菌，在將大腸桿菌進行大量培養(yǎng)后，通過添加一定濃度的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白表達，該蛋白得到了成功的表達。通過Co2+親和層析技術(shù)對該蛋白進行了純化，但是在蛋白純化后的蛋白復(fù)性中，該蛋白出現(xiàn)了大量的析出，在后續(xù)的實驗中,復(fù)性條件還需要進一步的摸索。
　　4.根據(jù)已經(jīng)公布的F0-ATP合

7、酶的部分序列設(shè)計相應(yīng)的引物，采用 RACE方法克隆得到了凡納濱對蝦的F0-ATP合酶基因的全長cDNA序列。生物信息學(xué)分析顯示，該基因的開放閱讀框744 bp，編碼248個氨基酸，分子量為28.2 kD。Blast結(jié)果顯示，克隆得到的cDNA序列所編碼的氨基酸序列與海虱(Caligus clemensi) F0-ATP合酶β亞基的同源性為50％,與黑腹果蠅(Drosophila melanogaster) F0-ATP合酶β亞基的同源性