家蠶30K蛋白LP7的分離純化及功能初探.pdf

1、家蠶30K蛋白是在家蠶血液中大量表達的一類低分子量脂蛋白，也是桑蠶特有的一類蛋白質(zhì)。該類蛋白由脂肪體合成，并分泌到血液中，它們是家蠶生長發(fā)育過程中的主要存儲蛋白。之一，也是家蠶胚胎發(fā)育的重要能源物質(zhì)。30K蛋白成員眾多，其氨基酸序列同源性較高，因此對這類蛋白進行分離純化較為困難。目前，已經(jīng)分離純化出的30K蛋白只有4種。家蠶基因組框架圖的完成為我們提供了大量的數(shù)據(jù)資源，利用這些數(shù)據(jù)預(yù)測到10個30K蛋白基因，這些基因所編碼的氨基酸數(shù)目在

2、246-271個之間，理論等電點在6.1-8.4之間，分子量在28-31kD之間，它們的氨基酸序列同源性都在60％以上。本研究通過分析各類30K蛋白的理論等電點和分子量，設(shè)計并開展了30K蛋白的純化工作，獲得了一種新的30K蛋白，在此基礎(chǔ)上對該蛋白進行了相關(guān)的分析和研究，主要結(jié)果如下： 本研究首先參考了10個30K蛋白的理論分子量和等電點，設(shè)計了分離純化的實驗流程和實驗條件。通過硫酸銨沉淀和三種層析分離技術(shù)(陽離子交換層析、陽離

3、子交換層析和疏水層析)，對家蠶血液蛋白質(zhì)進行分離純化，最終獲得一種30K蛋白。通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MACDI-TOF-MS)檢測，所獲得的蛋白樣晶信號峰單一。同時，通過MALDI-TOF-MS獲得該蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprint

4、ing,PMF)，利用GPMAW(General Protein/MassAnalysis for Windows)軟件搜索家蠶蛋白質(zhì)理論數(shù)據(jù)庫，該蛋白被鑒定為30K蛋白基因Bmlp7編碼的蛋白LP7，且其序列與已報道的所有30K蛋白序列均有較大差異。 利用多克隆抗體制備技術(shù)，將分離純化獲得的30K蛋白LP7作為抗原，采取多次皮下注射的方法對家兔進行免疫，頸動脈放血法采集血液，獲得其抗血清。通過飽和硫酸銨沉淀法粗提抗血清中的抗體

5、，去掉了人量雜質(zhì)和部分雜蛋白，最后獲得了抗30K：蛋白LP7的抗體粗品，達到下一步實驗的要求。 通過Western blot技術(shù)，分別對家蠶5齡起、5齡第3天和羽化第3天的各個組織器官進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5齡起時，只在血液中檢測到LP7；5齡3天時，血液中的LP7雜交信號強度明顯增加，此外，在頭、脂肪體和生殖腺中均檢測到LP7，體壁和中腸中也有少量LP7存在，而絲腺和馬氏管中沒有檢測到任何雜交信號。同時，分析家蠶5齡3天組織芯片

6、數(shù)據(jù)，結(jié)果表明Bmlp7基因在頭、脂肪體、體壁和生殖腺中表達，其中頭的表達量最高，在絲腺和馬氏管中只有微量表達，而在中腸和血液中沒有表達。因此，我們推測5齡第3天血液中增加的LP7蛋白是由脂肪體中合成后轉(zhuǎn)移而來的；中腸的微量LP7可能從血液中轉(zhuǎn)移而來；絲腺和馬氏管中Bmlp7基因的表達量較低，導(dǎo)致蛋白水平上檢測不到。對羽化第3天的組織器官進行檢測，發(fā)現(xiàn)所有組織中均存在LP7，但此時該蛋白在雌性生殖腺中的信號強度遠遠高于其他組織。LP7蛋

7、白在家蠶大量組織器官中的廣泛存在，暗示該蛋白在家蠶的生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。同時，利用Western blot技術(shù)對家蠶部分時期的血液與生殖腺進行對比分析。發(fā)現(xiàn)在血液中，從5齡第3天開始檢測到明顯LP7雜交信號，并且隨著生長發(fā)育的進行其強度逐漸增加，到化蛹第1天達到最大值，而后逐漸降低，羽化第3天時雜交信號已非常微弱；而在生殖腺中。5齡第3天的LP7雜交信號非常微弱，而后逐漸增加，蛾期達到最大值。這一結(jié)果表明生殖腺中的LP7蛋

8、白可能是由血液中轉(zhuǎn)移而來，并參與了卵母細胞的形成，推測該蛋白在家蠶胚胎發(fā)育過程中起著一定作用，可能是胚胎發(fā)育的重要能源物質(zhì)。檢測化蛹第6天的雌雄生殖腺，結(jié)果顯示雌雄生殖腺中均存在LP7，表明該蛋白在家蠶生殖發(fā)育過程中具有重要作用。進一步分析家蠶芯片時期表達譜，結(jié)果表明30K蛋白基因Bmlp7的表達量從5齡后期急速增加，吐絲前后達到最大，此后急劇下降，從上簇后的一段時間到化蛹4天，其表達又有緩慢上升的趨勢，化蛹5天后表達量有所降低，到化蛾

9、時義上升。而已有的研究報道表明該基因在脂肪體中的表達只持續(xù)到化蛹第5天．因此，推測30K蛋白LP7從血液轉(zhuǎn)移到生殖腺的同時，其他組織中也可能合成該蛋白。 此外，利用玻璃毛細管注射器．將黑曲霉菌(一種真菌)注射到化蛹3天的蠶蛹體內(nèi)，分別提取注射24h和48h后的血液，通過Westem blot技術(shù)檢測血液中30K蛋白LP7的變化情況。發(fā)現(xiàn)在注射黑曲霉菌的家蠶蛹期血液中LP7雜交信號有微弱增強，而對照組中，LP7雜交信號趨于降低。注

10、射黑曲霉菌后，血液中的LP7有增加的趨勢。這可能是由于黑曲霉菌導(dǎo)致家蠶體內(nèi)Bmlp7基因mRNA的表達量增加，也可能是外來物質(zhì)在某種程度上阻止了血液中LP7蛋白的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致血液中LP7蛋白含量增加。這一結(jié)果暗示30K蛋白LP7可能與家蠶免疫系統(tǒng)相關(guān)。 綜上所述，本研究從家蠶血液中分離純化到一種新的30K蛋白LP7。并制備了LP7蛋白的多克隆抗體，結(jié)合30K蛋白基因Bmlp7的芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果，對該蛋白的功能進行了初步研究。為