細胞外HSP70-PCs通過TLR2-4-JNK1-2MAPK通路促進肝癌細胞增殖.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌是嚴重威脅我國人民健康的惡性腫瘤之一，目前我國肝癌患者死亡率居高不下。根據(jù)現(xiàn)有認識，慢性肝損害刺激肝細胞過度增殖是肝細胞肝癌發(fā)生的主要病理機制之一。熱休克蛋白(heat shock Protein，HSP)又稱應(yīng)激蛋白，廣泛存在于原核、真核細胞中，進化上高度保守。在HSP家族中，HSP70亞族在細胞內(nèi)的含量最多，免疫原性最強，因此成為研究的重點。我們認為HSP70作用的多樣性，除了與受到的應(yīng)激刺激多樣和分布的

2、細胞種類有關(guān)外，主要與HSP70在組織中的分布位置有關(guān)。根據(jù)HSP70在組織中的不同分布，可以將其分為細胞內(nèi)HSP70和細胞外HSP70。在某些病理狀態(tài)下，如腫瘤進展或炎癥反應(yīng)中，細胞內(nèi)HSP70及HSP70肽復(fù)合物（HSP70-Peptide Complexes，HSP70-PCs）可以通過分泌、胞吐和細胞破裂、壞死而被釋放到細胞外。釋放到細胞外的HSP70/HSP70-PCs能調(diào)控腫瘤的多種生物學(xué)行為，包括增殖，侵襲等。但是，細胞外

3、HSP70/HSP70-PCs是跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制目前尚不清楚。Toll樣受體(TLRs)是一類天然免疫受體家族，在機體的固有免疫反應(yīng)中起重要作用。TLRs能夠識別不同外源性刺激并將信號進一步進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞釋放大量物質(zhì)，包括HSP70、TNF-α等。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)包括肝癌細胞在內(nèi)的多種腫瘤細胞表面均有TLRs的表達。那么在肝癌細胞中，細胞外HSP70/HSP70-PCs是否通過TLRs介導(dǎo)的跨膜作用發(fā)揮其功能？細胞外H

4、SP70/HSP70-PCs又是通過哪些轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)細信號的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而活化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖？本研究我們首先檢測肝癌組織中TLRs的表達情況，然后研究細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細胞增殖的改變，探討TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化途徑。
　　方法：
　　1、應(yīng)用MTT對比細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細胞株增殖的改變。然后阻斷TLR2與TLR4檢測細胞外HSP70/HSP70-PCs對

5、肝癌細胞增殖的影響。
　　2、應(yīng)用western blot與real-time RT-PCR檢測細胞外HSP70/HSP70-PCs對TLR2、TLR4表達的影響;應(yīng)用免疫共沉淀、GST Pull Down與放線菌酮檢測HSP70與TLR2、TLR4之間的關(guān)系。
　　3、利用western blot檢測和對比HSP70/HSP70-PCs刺激前后肝癌細胞JNK1/2、Cyclin D1蛋白的表達情況。然后檢測阻斷JNK1/2

6、后HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細胞株Cyclin D1蛋白的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1、細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細胞HepG2后明顯促進肝癌細胞增殖，而同時阻斷TLR2與TLR4能抑制細胞外HSP70/HSP70-PCs對肝癌細胞的促增殖作用。
　　2、細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細胞HepG2后TLR2、TLR4蛋白mRNA與蛋白明顯增加;細胞外HSP70/HSP70

7、-PCs能夠與TLR2、TLR4形成復(fù)合物并上調(diào)其穩(wěn)定性發(fā)揮其作用。
　　3、細胞外HSP70/HSP70-PCs刺激肝癌細胞HepG2后p-JNK1/2、Cyclin D1表達明顯增加，阻斷JNK1/2后Cyclin D1表達明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、細胞外HSP70/HSP70-PCs促進肝癌細胞增殖是通過與TLR2、TLR4形成復(fù)合物并上調(diào)其穩(wěn)定性發(fā)揮作用。
　　2、細胞外HSP70/HSP70-PC