非綜合征性前庭水管擴大患者拷貝數(shù)變異、KCNJ10基因的篩查及基因表達的研究.pdf

1、非綜合征性前庭水管擴大（non-syndromic Enlarged Vestibular Aqueduct，EVA）是一種最常見的內(nèi)耳畸形，其在感音神經(jīng)性聾的患者中約占10％左右。臨床表現(xiàn)為學(xué)齡前發(fā)病的感音神經(jīng)性聽力損失，部分患者存在有低頻骨氣導(dǎo)差，表現(xiàn)為混合性聽力損失；其聽力損失從輕度到極重度不等，聽力常呈現(xiàn)波動性或進行性下降，最終達重度或極重度，從而影響語言的學(xué)習(xí)或正常的交流。前庭水管擴大的患者在聽力下降前常有感冒、發(fā)熱、輕微頭部

2、外傷或其它使顱內(nèi)壓增高的誘發(fā)因素，因此對于該病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期干預(yù)成為預(yù)防或推遲其發(fā)病的有效措施。前庭水管擴大是一種常染色體隱性遺傳性疾病，其與染色體7q31上的SLC26A4基因突變有密切關(guān)系。在前庭水管擴大的患者中，約有65～92％的患者可以檢測到該基因的突變。SLC26A4基因?qū)儆陉庪x子轉(zhuǎn)運家族，有12個跨膜區(qū)，N末端和C末端位于細胞內(nèi)，表達于甲狀腺、腎臟和內(nèi)耳。介導(dǎo)硫酸根、碳酸氫根、甲酸根、草酸根、氫氧根、氯、碘及果糖

3、等多種單價或二價的離子的轉(zhuǎn)運，在機體離子成分平衡的維持中發(fā)揮重要作用。當SLC26A4基因發(fā)生突變后，突變體的蛋白表達及功能均發(fā)生變化，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。隨著對SLC26A4基因研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)該基因突變具有很大的異質(zhì)性：包括基因突變的形式、基因突變發(fā)生的位點及不同種族該基因突變圖譜等均存在有很大的異質(zhì)性。近年來的研究表明雖然非綜合征性前庭水管擴大和SLC26A4基因突變有密切的關(guān)系，但國內(nèi)外的研究均發(fā)現(xiàn)在相當一部分前庭水管擴大的

4、病人中，未找到SLC26A4基因突變或僅找到一個單等位基因突變。為了明確這部分病人的致病機理；探討其它遺傳因素在這部分病人的耳聾發(fā)病中的作用，本課題研究了拷貝數(shù)變異和參與內(nèi)淋巴鉀離子調(diào)節(jié)的基因-KCNJ10基因突變在非綜合征性前庭水管擴大的發(fā)病中的作用。為完善耳聾基因診斷的程序和方法提供依據(jù)。同時針對中國人群所特有的SLC26A4突變圖譜，選取了幾種常見的熱點突變，進行了SLC26A4基因突變后的表達研究，以期為進一步探索SLC26A4

5、基因突變的致病分子機制奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分 應(yīng)用MLPA方法對非雙等位基因突變的SLC26A4基因拷貝數(shù)變異的篩查
　　 拷貝數(shù)變異（CNVs）是指在人類基因組中廣泛存在的，從1000bp到數(shù)百萬bp范圍內(nèi)的缺失、插入、重復(fù)和復(fù)雜多位點的變異。是近年來發(fā)現(xiàn)的在人類基因組中除SNPs之外，另一類豐富的多態(tài)性來源，CNVs除廣泛存在于正常個體的基因組中，也與染色體重組和一些遺傳性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系。常規(guī)的一些檢測技術(shù)

6、無法檢測到CNVs的存在。
　　 為了解拷貝數(shù)變異是否在非綜合征性前庭水管擴大的發(fā)病機制中起作用，本部分研究應(yīng)用多重連接探針擴增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）技術(shù)對解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心所收集到的非綜合征性前庭水管擴大的患者中沒有檢測到SLC26A4基因任何突變及僅檢測到單個等位基因突變的患者進行SLC26A4基因拷貝數(shù)變異的篩查，尋找可能

7、存在的致病性的拷貝數(shù)變異。在39例未找到SLC26A4基因突變及68例僅找到SLC26A4單等位基因突變的非綜合征性前庭水管擴大的病人中；均未發(fā)現(xiàn)有明顯的拷貝數(shù)變異的存在?；谠囼灲Y(jié)果我們推斷有以下幾種可能：①SLC26A4基因的外顯子中確實不存在有拷貝數(shù)變異；因此拷貝數(shù)變異不構(gòu)成非綜合征性大前庭水管擴大的致病機制。②SLC26A4基因中存在有拷貝數(shù)的變異，但這些拷貝數(shù)變異沒有存在于開放閱讀框架區(qū)，而是存在于內(nèi)含子區(qū)或上、下游的調(diào)控區(qū)等

8、部位，用現(xiàn)有的MLPA檢測試劑盒無法檢測到。③在SLC26A4基因周圍或其他對SLC26A4起調(diào)控作用的基因中，存在有拷貝數(shù)變異，這些拷貝數(shù)變異通過改變這些基因的表達或功能，間接地影響SLC26A4基因，從而導(dǎo)致非綜合性前庭水管擴大的出現(xiàn)。
　　 本研究首次將CNVs應(yīng)用于非綜合征性前庭水管擴大病人的基因篩查，為非綜合征性前庭水管擴大病人的基因診斷提供了一個新的視角，從而完善該病的基因診斷。
　　 第二部分 非綜合征性前

9、庭水管擴大患者KCNJ10基因突變的篩查
　　 KCNJ10基因位于人類染色體1q23，編碼一種內(nèi)向整流性鉀離子通道，主要表達在大腦，內(nèi)耳和腎臟。在內(nèi)耳中，KCNJ10基因編碼的鉀離子通道主要表達在血管紋，對于耳蝸電位（EP）的形成起重要作用，血管紋產(chǎn)生耳蝸電位（EP）并向耳蝸內(nèi)淋巴分泌鉀離子。耳蝸電位是耳蝸轉(zhuǎn)導(dǎo)電流的主要驅(qū)動力量；鉀離子電流是最主要的耳蝸轉(zhuǎn)導(dǎo)電流。耳蝸轉(zhuǎn)導(dǎo)電流產(chǎn)生了聽力。KCNJ10突變可以導(dǎo)致耳蝸電位的消失，

10、從而導(dǎo)致聽力的損失。近年來的研究表明在Pendred綜合征和非綜合征性的前庭水管擴大中有KCNJ10基因突變的存在，由此推測KCNJ10基因突變在非綜合征性的前庭水管擴大的發(fā)病機制中起作用。
　　 為了解KCNJ10基因突變是否在非綜合征性前庭水管擴大的發(fā)病機制中起作用，本部分研究對解放軍總醫(yī)院聾病分子診斷中心所收集到的非綜合征性前庭水管擴大的患者進行了KCNJ10基因突變的篩查。在107例攜帶SLC26A4單雜合突變及未檢測到

11、突變的病例中，共檢測到3例KCNJ10基因突變，其中有812 G>A雜合突變2例，1042 C>T雜合突變1例。在311例已篩查到SLC26A4基因雙等位基因突變（純合突變和復(fù)合雜合突變）患者中共篩查到12例KCNJ10突變；其中812G>A雜合突變11例；1042C>T雜合突變1例。在229例正常人中共篩查到14例KCNJ10突變；其中812G>A雜合突變11例，1042C>T雜合突變2例，811C>T雜合突變1例。對那些帶有SLC2

12、6A4雙等位基因突變，同時又帶有KCNJ10基因突變患者的父母進行上述兩個基因的篩查，結(jié)果表明其父母中必有一方為同時帶有SLC26A4和KCNJ10單雜合的攜帶者，但是臨床癥狀卻表現(xiàn)正常，既沒有聽力的下降，也沒有前庭水管的擴大。這同國外有關(guān)研究的觀點截然不同。根據(jù)以上實驗結(jié)果我們初步得出以下幾種推論：①KCNJ10的單雜合突變在中國人群中是一種普遍存在的現(xiàn)象；②中國人群中KCNJ10最常見的突變類型是812G>A；③KCNJ10雖然在耳

13、蝸電位及聽覺形成過程中起重要作用，但KCNJ10的單雜合突變和Pendred綜合征及非綜合征性前庭水管擴大之間并沒有必然的聯(lián)系；④KCNJ10和SLC26A4的復(fù)合雜合突變不一定導(dǎo)致Pendred綜合征或非綜合征性前庭水管擴大：對于同時有SLC26A4和KCNJ10基因單雜合突變的非綜合征性前庭水管擴大患者，其致病原因有可能并不是由KCN110突變引起的，而有可能是由于其他原因，如另一種目前我們尚未知的基因突變或環(huán)境與基因的相互作用引起

14、的。
　　 本研究初步分析了KCNJ10與非綜合征性前庭水管擴大之間的關(guān)系，表明了KCNJ10基因突變和非綜合征性前庭水管擴大的發(fā)生沒有必然的聯(lián)系，為完善非綜合征性前庭水管擴大的基因診斷提供了依據(jù)。
　　 第三部分 中國人群中非綜合征性前庭水管擴大患者常見的SLC26A4基因突變的表達研究
　　 SLC26A4基因突變可引起Pendred綜合征或非綜合征性前庭水管擴大。SLC26A4基因突變具有很大的異質(zhì)性。基因

15、突變的形式，不同種族該基因突變圖譜等均存在有很大的異質(zhì)性。這些異質(zhì)性提示SLC26A4突變后其致病的分子機制有可能也存在一定的異質(zhì)性。中國人群中SLC26A4突變圖譜和世界上其他人群的突變圖譜有著明顯的不同。在中國人群中常見的幾種熱點突變類型是IVS7-2A>G；2168A>G（H723R）：1174A>T（N392Y）；1229C>T（T410M）；2027T>A，而這些突變引起的分子功能改變的具體機制目前為止尚未見報道。因此，本研究

16、即以中國人群中最常見的突變類型為研究對象，構(gòu)建上述幾種常見的SLC26A4突變質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中，以觀察其突變發(fā)生后在細胞內(nèi)的表達情況，結(jié)果顯示在本實驗中所選取的四種SLC26A4基因突變發(fā)生后，其編碼的Pendrin蛋白均滯留在細胞質(zhì)內(nèi)，而野生型Pendrin蛋白則表達于細胞膜上，由此推測SLC26A4突變發(fā)生后，其編碼的Pendrin蛋白無法定位于胞膜上，而滯留于細胞質(zhì)內(nèi)，無法完成正常的陰離子交換功能，從而導(dǎo)致疾病