ZNF580在ROS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、ZNF580是由本課題組克隆的一種新的鋅指蛋白基因,該基因定位于人19號(hào)染色體19q13.42,最初是以LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304,篩選人主動(dòng)脈cDNA文庫得到的新基因(Genbank注冊(cè)號(hào):AF184939),國(guó)際人類基因命名委員會(huì)命名為ZNF580。ZNF580與Krüppel樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like factors,Klfs)家族成員類似,其功能仍在進(jìn)一步研究中,本實(shí)驗(yàn)旨在探討ZNF580在ROS介導(dǎo)

2、的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 目的:
　　 以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.hy926)為體外模型,在典型的活性氧(reactive oxygen species,ROS)-H2O2的作用下,研究人C2H2型鋅脂蛋白新基因ZNF580表達(dá)情況,分析ZNF580基因表達(dá)與氧化應(yīng)激相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB轉(zhuǎn)錄激活之間的關(guān)系,以及ZNF580基因過表達(dá)對(duì)炎癥因子IL-8的釋放和單核細(xì)胞遷移趨化的影響,進(jìn)一步揭示ZN

3、F580在ROS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。
　　 方法:
　　 1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.hy926),用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。
　　 2 H2O2是一個(gè)細(xì)胞損傷的刺激因素,而LDH(乳酸脫氫酶)是反映細(xì)胞膜完整性的重要檢測(cè)指標(biāo)。為確定H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷情況,不同濃度H2O2(0-600μM)作用于EA.hy926細(xì)胞6h后,提取細(xì)胞上清,采用LD

4、H活性檢測(cè)分析H2O2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。
　　 3胰酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EA.hy926細(xì)胞,將其懸浮于高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中,濃度約為5-6×106/ml,接種到六孔板中2 ml/孔,37℃,5％CO2孵箱培養(yǎng)。在各孔內(nèi)加H2O20μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM,每組設(shè)三個(gè)平行孔。1h后收集細(xì)胞,提取總RNA和蛋白,利用半定量RT-PCR、Western blot方法檢測(cè)不同濃度H2O2對(duì)

5、ZNF580表達(dá)的影響。
　　 4在各孔中加入濃度為100μ的H2O2,每組設(shè)三個(gè)平行孔,于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h后收集細(xì)胞,提取總RNA和蛋白,同樣利用半定量RT-PCR、Wegern blot方法檢測(cè)不同作用時(shí)間的H2O2對(duì)ZNF580表達(dá)的影響。
　　 5內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)不同處理后,實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、H2O2處理組、PDTC干預(yù)組和DMSO對(duì)照組。各組細(xì)胞爬片后固定,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)H2O2和特異性抑制劑P

6、DTC對(duì)NF-κB亞基p65激活表達(dá)的影響。
　　 6同樣EA.hy926細(xì)胞分為不同的處理方式,抽提RNA以及蛋白,利用半定量RT-PCR擴(kuò)增和Western blot方法檢測(cè)H2O2是否通過NF-κB信號(hào)通路影響和調(diào)節(jié)ZNF580的表達(dá)。
　　 7利用pEGFP-ZNF580和pEGFP-C1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞,獲得瞬時(shí)過表達(dá)ZNF580的EA.hy926細(xì)胞。運(yùn)用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,RT-PC

7、R以及western-blot技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)染后ZNF580的表達(dá)情況。
　　 8運(yùn)用real-time PCR技術(shù)從轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)構(gòu)建的瞬時(shí)高表達(dá)ZNF580內(nèi)皮細(xì)胞和正常內(nèi)皮細(xì)胞中白介素-8的表達(dá)差異。以ELISA方法從蛋白表達(dá)水平檢測(cè)構(gòu)建的瞬時(shí)高表達(dá)ZNF580內(nèi)皮細(xì)胞和正常內(nèi)皮細(xì)胞中白介素-8的表達(dá)差異。
　　 9人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株(THP-1),用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO2

8、、飽和濕度下培養(yǎng)。遷移趨化實(shí)驗(yàn)分析瞬時(shí)高表達(dá)ZNF580內(nèi)皮細(xì)胞和正常內(nèi)皮細(xì)胞中IL-8對(duì)單核細(xì)胞株THP-1遷移率的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1不同濃度H2O2作用于EA.hy926細(xì)胞,LDH測(cè)定結(jié)果顯示,H2O2濃度為400μM時(shí),LDH的釋放量最大。
　　 2不同濃度H2O2作用EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞1h后,提取RNA擴(kuò)增ZNF580片段,以及western-blot觀察ZNF580的蛋白表達(dá)水平,結(jié)

9、果證實(shí),ZNF580在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)均有增加,并呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢(shì)。(P＜0.05)。在濃度為100μM時(shí),ZNF580的表達(dá)最高。
　　 3濃度為100μ的H2O2作用EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間后,由RT-PCR和western-blot檢測(cè)可知ZNF580 mRNA和蛋白水平的表達(dá)增加(P＜0.05)。在刺激時(shí)間為1h時(shí),ZNF580的表達(dá)最高。
　　 4 H2O2作用可激活NF-κB亞基p6

10、5由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,而特異性抑制劑PDTC存在時(shí),可抑制NF-κB亞基p65在EA.hy926細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)位。陰性對(duì)照DMSO未引起p65核轉(zhuǎn)位。對(duì)照組可見棕色顆粒位于細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中未見。
　　 5 NF-κB信號(hào)通路抑制劑PDTC和H202共同處理可抑制ZNF580 mRNA及蛋白的上調(diào)表達(dá),而單獨(dú)H202的處理可明顯上調(diào)ZNF580 rnRNA及蛋白的表達(dá)。6脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ZNF580質(zhì)粒于EA.hy926細(xì)胞中,成

11、功構(gòu)建瞬時(shí)高表達(dá)ZNF580的EA.hy926細(xì)熒光顯微鏡鑒定轉(zhuǎn)染效率為50％左右,RT-PCR和western-blot鑒定結(jié)果顯示:與轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染pEGFP-ZNF580的細(xì)胞ZNF580表達(dá)量顯著升高(P＜0.01)。
　　 7 Real-time PCR及ELISA分析結(jié)果表明,高表達(dá)ZNF580的EA.hy926細(xì)胞中IL-8的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)顯著增高。高表達(dá)ZNF580的EA.hy926

12、細(xì)胞表達(dá)的IL-8顯著高于正常細(xì)胞(P＜0.01)。
　　 8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析結(jié)果表明,高表達(dá)ZNF580的EA.hy926細(xì)胞對(duì)單核細(xì)胞THP-1遷移趨化作用有明顯的促進(jìn)作用,與正常組比較結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 H2O2通過NF-κB信號(hào)通路影響ZNF580的表達(dá),進(jìn)一步促進(jìn)其下游的炎癥因子IL-8的釋放,ZNF580在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。該研究闡明