高糖對人腎小球系膜細(xì)胞CTGF啟動子去甲基化的影響.pdf

1、目的: 觀察高糖和甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-dCyd）對人腎小球系膜細(xì)胞（HMCs）結(jié)締組織生長因子（CTGF）基因啟動子的甲基化狀態(tài)和基因表達(dá)的影響。 方法: （1）用含不同濃度D-葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基（5mM（正常糖）、30mM（高糖））培養(yǎng)HMCs（0、24、48、72h），分別于各時間點提取基因組DNA、總RNA、蛋白質(zhì)，并收集細(xì)胞培養(yǎng)液。MSP檢測細(xì)胞CTGF基因啟動子的甲基化

2、狀態(tài)，RT-PCR檢測CTGF mRNA表達(dá)，Western印跡檢測CTGF蛋白的表達(dá)，ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中纖維連接蛋白（FN）的表達(dá)。（2）用不同濃度5-aza-dCyd（0、1、2、5、10uM）刺激HMCs48h，提取細(xì)胞基因組DNA、總RNA和蛋白質(zhì)。MSP檢測細(xì)胞CTGF基因啟動子的甲基化狀態(tài)，RT-PCR檢測CTGFmRNA表達(dá)，Western印跡檢測CTGF蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: （1）正常糖組HMCs

3、各時間點CTGF基因啟動子呈半甲基化狀態(tài)；高糖組HMCs CTGF基因啟動子在0h呈半甲基化狀態(tài)，甲基化條帶較強；24h甲基化條帶減弱，非甲基化條帶增強；48h甲基化陰性，呈完全去甲基化狀態(tài)；72h重新出現(xiàn)甲基化條帶，非甲基化條帶減弱。（2）正常糖組HMCs不同時間點表達(dá)微量的CTGFmRNA和蛋白質(zhì)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）；高糖作用細(xì)胞24h、48h、72h，與0小時比較CTGF mRNA和蛋白質(zhì)均表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意

4、義（均P<0.01），CTGF mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)高峰均在48h。高糖刺激細(xì)胞24h、48h、72h，與正常糖組各相應(yīng)時間點比較CTGFmRNA表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別為P<0.01，P<0.01，P<0.05）；高糖刺激細(xì)胞24h、48h、72h，與正常糖組各相應(yīng)時間點比較CTGF蛋白表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。（3）正常糖組HMCs不同時間點培養(yǎng)液上清中均有FN表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.0

5、5）；高糖作用細(xì)胞24h、48h、72h，與0小時比較FN表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01），F(xiàn)N的表達(dá)高峰在72h；高糖作用細(xì)胞24h、48h、72h，與正常糖組相應(yīng)時間點比較FN表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。（4）經(jīng)不同濃度5-aza-dCyd處理48h，0、1、2、5uM5-aza-dCyd組CTGF基因啟動子呈半甲基化狀態(tài)，10uM5-aza-dCyd組CTGF基因啟動子甲基化陰性，呈完全去甲基化狀

6、態(tài)。（5）0、1、2、5uM5-aza-dCyd組均有微量CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）。與OuM5-aza-dCyd組比較，10uM5-aza-dCyd組CTGFmRNA和蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。 結(jié)論: 高糖誘導(dǎo)HMCs CTGF基因啟動子的去甲基化，刺激CTGF的表達(dá)和FN的分泌，呈時間依賴性；5-aza-dCyd誘導(dǎo)HMCs CTGF基因啟動子的去甲基