豬LIN28、KLF4、c-MYC和OCT4基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及重組蛋白制備.pdf

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）自誕生以來，由于和胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）一樣既有自我更新、無限增殖能力，又有分化形成機(jī)體幾乎全部類型細(xì)胞的潛能，在再生醫(yī)學(xué)、畜禽種質(zhì)資源保護(hù)與創(chuàng)新和生物學(xué)基礎(chǔ)研究等方面極具應(yīng)用價(jià)值，因而迅速成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的前沿?zé)狳c(diǎn)。如今，人們已成功獲得了包括豬在內(nèi)的多種家養(yǎng)動(dòng)物的iPSCs，打破了長期未能獲取豬和其

2、它家畜真正ESCs的窘境。然而，iPSCs仍面臨質(zhì)量參差不齊、效率低和安全性不確定等突出問題。利用重組蛋白或小分子化合物誘導(dǎo)iPSCs為克服外源基因插入所可能導(dǎo)致的安全隱患奠定了良好基礎(chǔ)。但至今關(guān)于重組蛋白誘導(dǎo)豬iPSCs的報(bào)道十分有限。本研究將分別構(gòu)建豬LIN28、KLF4、c-MYC和OCT4四種基因與細(xì)胞穿膜肽11R融合表達(dá)的原核載體，并重點(diǎn)探討制備豬LIN28-11R可溶性融合重組蛋白的優(yōu)化條件，同時(shí)對(duì)另三種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白的表

3、達(dá)條件進(jìn)行初步探索，以期為今后利用這四種重組蛋白誘導(dǎo)獲取豬iPSCs奠定基礎(chǔ)。具體試驗(yàn)及結(jié)果如下：
　　1.豬LIN28、KLF4、c-MYC及OCT4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定。首先，用Optimum Gene軟件對(duì)豬 OCT4（NP_001106531）、KLF4（NP_001026952）、c-MYC（NP_001005154）、LIN28（NP_001116605）基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在目的基因3’端加上編碼Lin

4、ker和穿膜肽11R的基因序列。通過人工合成的方法獲得目的基因，再亞克隆至pET30a載體中。
　　酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明，成功構(gòu)建出pET30a-NdeI-Oct4-linker-11R-XhoI-His、pET30a-NdeI-Lin28-linker-11R-XhoI-His、pET30a-NdeI-Klf4-linker-11R-XhoI-His、pET30a-NdeI-c-Myc-linker-11R-Xho I-H

5、is四種穿膜肽與多能性轉(zhuǎn)錄因子融合表達(dá)的原核載體。
　　2.豬源LIN28-11R重組蛋白制備及其它三種轉(zhuǎn)錄因子重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的初步探索。將重構(gòu)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，在不同的時(shí)間和溫度條件下誘導(dǎo)表達(dá)，篩選出LIN28-11R重組蛋白的最佳表達(dá)條件，并進(jìn)行大量表達(dá)；蛋白產(chǎn)物經(jīng)純化和鑒定后進(jìn)行細(xì)胞穿膜添加實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證其是否具有穿透細(xì)胞膜的能力。同時(shí)，對(duì)另外三種多能性因子重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了初步探索。
　　本

6、試驗(yàn)最終獲得并純化出了可溶性的豬LIN28-11R重組蛋白，該重組蛋白具有穿透細(xì)胞膜的能力。而初步研究發(fā)現(xiàn)，OCT4-11R、KLF4-11R和c-MYC-11R三種重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件可能是：KLF4-11R在37℃誘導(dǎo)4h時(shí)表達(dá)量相對(duì)較高，并在菌體裂解液上清中表達(dá)量較高；c-MYC-11R在37℃誘導(dǎo)4h的條件下有表達(dá)，且只在菌體裂解液及裂解液沉淀中表達(dá)；OCT4-11R在不同溫度（37℃、30℃）條件下幾乎均未表達(dá)。