MicroRNA-101對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡和侵襲等生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分MicroRNA-101在人骨肉瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　目的：探討人骨肉瘤組織和細(xì)胞中miRNA-101的表達(dá)變化及臨床意義。
　　方法：收集華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院骨科骨腫瘤組織庫31例人骨肉瘤組織標(biāo)本和31例非髖關(guān)節(jié)腫瘤疾病行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后的正常骨組織標(biāo)本（骨膜組織），應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法檢測(cè)31例人骨肉瘤組織標(biāo)本和31例正常骨組織標(biāo)本的miRNA-101表達(dá)變化；同時(shí)應(yīng)用qRT-

2、PCR方法檢測(cè)人骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞和人成骨細(xì)胞系hFOB1.19細(xì)胞miRNA-101的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：MiRNA-101在31例骨肉瘤組織和正常骨組織中的均有表達(dá)，骨肉瘤組織中miRNA-101的表達(dá)顯著低于正常骨組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MiRNA-101在人骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞和人成骨細(xì)胞系hFOB1.19細(xì)胞中同樣有表達(dá)，且成骨細(xì)胞miRNA-101的表達(dá)顯

3、著高于骨肉瘤細(xì)胞MG63和骨肉瘤細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而骨肉瘤細(xì)胞MG63和Saos-2中miRNA-101的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：與正常骨組織及成骨細(xì)胞相比，骨肉瘤組織及骨肉瘤細(xì)胞中miRNA-101的表達(dá)顯著減低，miRNA-101可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分 MicroRNA-101對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討miRNA-101對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖

4、、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲以及遷移等的生物學(xué)特性的影響。
　　方法：以LipofectamineTM2000為載體，將miRNA-101模擬物及miRNA-101陰性對(duì)照模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細(xì)胞系MG63細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)成三組分別為空白對(duì)照組、模擬物陰性對(duì)照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)三組細(xì)胞miRNA-101的表達(dá)，MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)三組細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞

5、儀檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期變化，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)三組細(xì)胞的侵襲及遷移能力。
　　結(jié)果：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24h后，通過熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)70％以上的細(xì)胞內(nèi)有熒光分布時(shí)此組細(xì)胞可行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞miRNA-101的RQ值分別是空白對(duì)照組（1.31±0.32）、陰性對(duì)照組（1.35±0.31）和miRNA-101模擬物組（3.86±0.28）。模擬物

6、轉(zhuǎn)染組miRNA-101的表達(dá)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯上調(diào)，相應(yīng)增加了2.95倍和2.86倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，miRNA-101表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.87）。MiRNA-101的mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)，表明轉(zhuǎn)染組骨肉瘤MG63細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染了miRNA-101模擬物。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比較，miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞的增值速率明顯降低，凋亡率增高，細(xì)胞周期停滯

7、在G1期前（細(xì)胞周期阻滯），腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：MiRNA-101可明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯。MiRNA-101可能是一種骨肉瘤抑癌基因，參與骨肉瘤的發(fā)生、進(jìn)展。
　　第三部分 MicroRNA-101靶基因的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探尋miRNA-101調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)特性改變的可能靶基因，分析miR

8、NA-101發(fā)揮調(diào)控作用的可能機(jī)制，為深入研究miRNA-101的調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：利用TargetScan、miRecord和Pictar等生物信息學(xué)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)miRNA-101的靶基因，篩選miRNA-101的候選靶基因。確認(rèn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）為候選靶基因之一，擴(kuò)增包含候選靶基因
　　3'-UTR的基因片段（3'-UTR-mTO

9、R-Wt）并將其亞克隆至熒光素酶報(bào)告基因pGL3載體上（pGL3-3'-mTOR-Wt）并對(duì)此重組載體進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建為pGL3-3'-UTR-mTOR-Mut載體。利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)miRNA-101與候選靶基因mTOR的結(jié)合情況，明確其是否為miRNA-101的作用靶基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)三組細(xì)胞miRNA-101的表達(dá)以及候選靶基因mTOR在骨肉瘤細(xì)胞空白對(duì)照組、模擬物陰性對(duì)照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組中的m

10、RNA表達(dá)。Western Blot檢測(cè)以上三組骨肉瘤細(xì)胞mTOR的蛋白表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用Western Blot檢測(cè)三組細(xì)胞即空白組、轉(zhuǎn)染mTOR小干擾RNA（mTOR-siRNA）組以及轉(zhuǎn)染mTOR-siRNA陰性對(duì)照組）的mTOR蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：靶點(diǎn)分析軟件初步推定mTOR為miRNA-101的候選靶基因之一。而熒光素酶報(bào)告基因也證實(shí)了此推定的正確性，在熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)中，共轉(zhuǎn)染miRNA-101模擬物和pGL3-3'

11、-mTOR-Wt組與共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照物和pGL3-3'-UTR-mTOR-Mut組相比，前組的熒光強(qiáng)度明顯降低，較后者減低了0.46，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MTOR的mRNA表達(dá)量在miRNA-101模擬物組較其它兩組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western Blot檢測(cè)表明，miRNA-101模擬物組mTOR蛋白的表達(dá)較其余兩組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組mTOR的蛋

12、白表達(dá)最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：mTOR為miRNA-101的候選靶基因之一，miRNA-101可同時(shí)抑制mTOR的mRNA及蛋白表達(dá)。MiRNA-101調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的改變可能是通過調(diào)節(jié)mTOR通路關(guān)鍵分子mTOR而發(fā)揮作用。
　　第四部分 MicroRNA-101調(diào)控哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討miRNA-101是否通過調(diào)控哺乳

13、動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR而影響人骨肉瘤細(xì)胞的增值和凋亡。
　　方法：以人骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為如下幾部分：⑴細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成三組分別為空白對(duì)照組、模擬物miRNA-101陰性對(duì)照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組。⑵細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成三組分別為空白對(duì)照組、mTOR-siRNA陰性對(duì)照組以及mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組。⑶細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成兩組分別為模擬物
　　miRNA-101+mTOR-siRNA陰性對(duì)

14、照共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組。⑷細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成兩組分別為模擬物miRNA-101+mTOR-siRNA共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組。采用MTT法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)以上各組骨肉瘤細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)以上各組骨肉瘤細(xì)胞的凋亡變化。
　　結(jié)果：在miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組、模擬物miRNA-101+mTOR-siRNA陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組，人骨肉瘤細(xì)胞的增殖均受到明顯抑制，而細(xì)胞凋