小鼠瘦素的原核表達及純化.pdf

1、瘦素(1eptin)是肥胖基因(obese gene,ob基因)的產(chǎn)物,具有抑制攝食、調(diào)節(jié)脂肪沉積與能量代謝的功能.1950年,Ingalls等首次發(fā)現(xiàn)并提出了ob基因的概念.1994年,Zhang等應用定向克隆技術(shù),克隆了人與小鼠的ob基因.Leptin的作用除與肥胖有關(guān)外,對多種生理過程都有調(diào)節(jié)作用,諸如生熱作用、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用、青春期的始動作用、生殖功能等.重組人leptin對于部分肥胖、糖尿病患者以及l(fā)eptin缺乏的個體或脂

2、肪萎縮性糖尿病患者具有一定的療效.該研究以克隆有小鼠肥胖基因的質(zhì)粒pMET mouse leptin為模板,PCR擴增小鼠的ob基因,定向克隆至原核表達載體pET-28a(+),構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-28a-lep.經(jīng)酶切、PCR鑒定和DNA序列檢測正確后,轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中,構(gòu)建工程菌株BL21-pET28-1ep.37℃培養(yǎng),經(jīng)IPTG誘導后,小鼠瘦素融合蛋白以包涵體形式高效表達.加入十二烷基肌氨酸鈉(Sarkosyl

3、),采用直接處理菌體的方法進行包涵體的變性與復性,達到了較好的效果.SDS-PAGE和Westernblotting分析結(jié)果顯示,工程菌株BL21-pET28a-lep正確表達了帶有His Tag的小鼠瘦素融合蛋白,所表達的融合蛋白分子量為22.5 KD,大小與理論值相符;IPTG誘導6h,融合蛋白具有最高表達量.薄層色譜分析結(jié)果顯示,目的蛋白最高表達量為菌體總蛋白的39.2%.應用Ni<'2+>親和交換柱進行了His融合蛋白的純化,純