TGFβ與創(chuàng)傷后晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化.pdf

1、目的： 對超聲乳化術(shù)后囊袋與正常晶狀體囊袋組織所表達(dá)的基因進(jìn)行篩查分析，探索調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞創(chuàng)傷后增生、分化、轉(zhuǎn)分化的潛在因素。觀察TGFβ2作用于人晶狀體上皮細(xì)胞后，通路轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的動態(tài)表達(dá)，及其對細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)分化特異性標(biāo)記物表達(dá)的影響。嘗試活體觀察不同分區(qū)晶狀體上皮細(xì)胞手術(shù)創(chuàng)傷后反應(yīng)差異。探索TGFβ對晶狀體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的效應(yīng)特點和機(jī)制。 方法： 1.使用DNA基因芯片技術(shù)對兔眼超聲乳化術(shù)后14d的晶狀體囊

2、袋組織和未手術(shù)眼囊袋組織所表達(dá)的差異基因進(jìn)行篩查。 2.體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞中添加10ng/mlhTGFβ2，用RT-PCR方法測定30min、1h、2h、8h、16h、24h等不同時點Smad4mRNA的表達(dá)，用Westernblot和免疫組織化學(xué)方法觀察上述時點p-Smad2/3的表達(dá)。 3.利用流式細(xì)胞技術(shù)測定TGFβ2刺激晶狀體上皮細(xì)胞后，24h和72h的細(xì)胞周期分布變化。RT-PCR檢測24h、48h和7

3、2h時點αSMA和COL-ⅠmRNA表達(dá)，免疫組織化學(xué)方法觀察αSMA和COL-Ⅰ蛋白表達(dá)。 4.將晶狀體中央前囊膜片再植入于兔眼超聲乳化術(shù)后囊袋中，組織切片觀察術(shù)后再植片與赤道部細(xì)胞形態(tài)變化，免疫組織化學(xué)法觀察兩者Smad4表達(dá)的差異。 結(jié)果： 1.DNA基因芯片檢測超聲乳化術(shù)后囊袋組織，可發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因47個，下調(diào)基因11個(以2.0倍顯著差異水平篩選)。其中包括TGFβ通路蛋白基因Smad7表達(dá)明顯上調(diào)2.2

4、倍；以及與細(xì)胞分裂轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因，如Fos、Csl等。 2.人晶狀體上皮細(xì)胞添加了外源性hTGFβ2后1h，即可出現(xiàn)Smad4mRNA表達(dá)轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度增高(0.18±0.02)，16h到達(dá)峰值(0.72±0.07)并至少持續(xù)至24h。與對照組存在顯著差異(P＜0.05)。30min測得p-Smad2/3的蛋白表達(dá)與對照組相似，但在2h后逐漸增強(qiáng)，與對照組出現(xiàn)明顯差異，16h達(dá)到峰值(2.53g/L)。免疫組織化學(xué)染色在16h有p-S

5、mad2/3顆粒胞漿表達(dá)，24h向核內(nèi)聚集。 3.TGFβ2作用晶狀體上皮細(xì)胞后24h，測得G0-G1期細(xì)胞百分比55.26±1.76％、S期細(xì)胞24.16±3.13％；72h測得G0-G1期細(xì)胞百分比64.56±3.72％，S期細(xì)胞35.38±3.71％，G0/S與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P＜0.05)。TGFβ2作用晶狀體上皮細(xì)胞后，24h和48h表達(dá)αSMAmRNA(0.37±0.05和1.31±0.07)，與對照組(

6、0和0.98±0.02)存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P＜0.05)；48h和72h表達(dá)COL-ⅠmRNA(0.62±0.20和0.54±0.21)，與對照組(0、0)存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P＜0.05)；48h細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則梭形改變；αSMA和COL-Ⅰ免疫組織化學(xué)染色陽性。 4.中央前囊膜片囊袋內(nèi)再植入模型構(gòu)建成功，術(shù)后14d，赤道部和中央前囊再植入片上細(xì)胞均出現(xiàn)增生和纖維化生表現(xiàn)；前囊再植片細(xì)胞Smad4表達(dá)陽性，赤道部為陰性。