全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體的篩選、鑒定及其靶向性實驗研究.pdf

1、目的：從全人源噬菌體單鏈抗體庫中大規(guī)模篩選抗肝癌噬菌體單鏈抗體(scFv)，鑒定其特異性；以綠色熒光蛋白(EGFP)為示蹤分子構(gòu)建、表達(dá)抗肝癌scFv與EGFP融合蛋白，體外、體內(nèi)實驗研究抗肝癌scFv的靶向特異性，為肝癌的臨床診斷和導(dǎo)向治療奠定基礎(chǔ)。 方法：用肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞和肝細(xì)胞系QSG-7701細(xì)胞對初級抗體庫進行正負(fù)淘洗富集以及ELISA篩選，選擇與肝癌細(xì)胞反應(yīng)強陽性而與肝細(xì)胞反應(yīng)弱陽性或者陰性的克隆進行免疫組

2、化鑒定并測序。測序后構(gòu)建陽性克隆SA3基因與EGFP融合基因的原核表達(dá)載體EGFP-SA3/pET-25b(+)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；變性條件下純化的融合蛋白EGFP-SA3用稀釋法復(fù)性以后與HepG2細(xì)胞經(jīng)體外孵育后在熒光顯微鏡下觀察單鏈抗體SA3與肝癌細(xì)胞的結(jié)合作用；然后通過尾靜脈將其注射入荷肝癌裸鼠體內(nèi)觀察EGFP-SA3的體內(nèi)靶向作用。 結(jié)果：對抗體庫進行三輪正負(fù)淘洗和富集，從第三輪淘洗后

3、的LB平板上隨機挑取2798個克隆進行間接法ELISA，得到979個與HepG2呈陽性反應(yīng)的克隆，陽性率為35％，其中有3個克隆與HepG2呈強陽性反應(yīng)，而與QSG-7701、HUVEC等人正常細(xì)胞系呈弱陽性或陰性。選擇克隆SA3進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果與ELIsA一致。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明SA3與肝癌組織和肝組織陽性率分別為72.1％和8.3％，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。重組表達(dá)載體EGFP-SA3/pET-25b(+)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

4、后SDS-PAGE顯示融合蛋白EGFP-SA3分子量大小為58 KD，主要以包涵體的形式存在；在變性的條件下用His-tag磁珠純化試劑盒純化并復(fù)性的EGFP-SA3與HepG2細(xì)胞孵育之后在熒光顯微鏡下觀察可見細(xì)胞膜上有明顯的綠色熒光聚積。體內(nèi)實驗表明，注射EGFP-SA3的荷肝癌小鼠的腫瘤部位有綠色熒光發(fā)出，而對照組小鼠的腫瘤部位未見熒光，顯示EGFP-SA3具有良好的腫瘤特異性。 結(jié)論：通過大規(guī)模的細(xì)胞ELISA篩選從噬菌