鼻咽癌放射敏感性的預(yù)測.pdf

1、我國是鼻咽癌發(fā)病率較高的國家之一，放射治療是鼻咽癌的主要治療手段。準(zhǔn)確地預(yù)測鼻咽癌的放射敏感性，顯得極為重要，但迄今尚未找到預(yù)測鼻咽癌放射敏感性的有效指標(biāo)。 實驗Ⅰ鼻咽癌放射敏感性與癌基因表達程度的相關(guān)關(guān)系近年來有文獻報道，經(jīng)癌基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其放射敏感性與癌基因表達程度有關(guān)。但目前尚未見到異常P53蛋白及bcl-2基因表達程度與鼻咽癌放射敏感性相關(guān)關(guān)系的研究報道。本實驗采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)測定鼻咽癌組織中異常P53蛋白及b

2、cl-2基因表達程度，并分析其與鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶放射敏感性之間的相互關(guān)系。 材料與方法: 1.病例： 2000年1月-2002年1月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院初次接受放射治療的鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病人61例。 2.放射治療：采用直線加速器6MV-x線進行外照射。 3.病灶大小的測量由專人隔日一次用游標(biāo)卡尺測量頸部最大淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的最大徑(a)及其垂直徑(b)，按腫瘤體積計算頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶體積。

3、 4.免疫組織化學(xué)染色所有病例的病理切片均行常規(guī)HE染色，及異常P53蛋白、bcl-2基因免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色方法采用SP法。 5.閱片： 由專人采用雙盲法閱片，計算陽性細(xì)胞數(shù)與全部腫瘤細(xì)胞數(shù)的比值：將比值為0.1-25％、26-50％、51％-75％，>75％的病例分別定義為-、+、++、+++、++++。 6.統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0軟件行統(tǒng)計學(xué)處理，用t檢驗比較各組均數(shù)，

4、相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。 結(jié)果： 癌基因表達程度與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶消退情況的相關(guān)關(guān)系： 以頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶在放射治療過程中體積縮小25％、50％、75％及完全消退所需的放射劑量代表其放射敏感性，即所需的放射劑量越小放射敏感性越高。在Spearman等級相關(guān)分析中，異常P53蛋白及bcl-2基因表達程度，與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶消退過程中所需放射劑量呈正相關(guān)(P<0.05)，即與放射敏感性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

5、 另外，異常P53蛋白含量與bcl-2基因表達程度無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。 討論： 本實驗分析結(jié)果顯示，異常P53蛋白及bcl-2基因表達程度與鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的放射敏感性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，異常P53蛋白表達程度與bcl-2基因表達程度之間無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。 異常P53蛋白可能是通過以下途徑影響腫瘤的放射敏感性： (1)異常P53蛋白一方面干擾DNA受損傷細(xì)胞的G1期抑制

6、，使其繼續(xù)進入S期。 (2)放射治療后當(dāng)DNA大量損傷時，異常P53蛋白減少受照射后的細(xì)胞凋亡。 bcl-2基因可能是通過減少放射所介導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡的途徑，來影響腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。 實驗Ⅱ鼻咽癌放射敏感性與細(xì)胞周期蛋白含量的相關(guān)關(guān)系有研究表明，某些細(xì)胞周期蛋白可能與一些腫瘤的預(yù)后及其內(nèi)在的放射敏感性有關(guān)。目前臨床上尚未見到有關(guān)細(xì)胞周期蛋白與鼻咽癌放射敏感性相關(guān)關(guān)系的研究報道。本實驗采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)測定鼻

7、咽癌組織中細(xì)胞周期蛋白PCNA、Ki-67及Cyclin B1含量，并分析其與鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶放射敏感性之間的相互關(guān)系。 材料與方法： 1.病例同實驗Ⅰ。 2.放射治療同實驗Ⅰ。 3.病灶大小的測量同實驗Ⅰ。 4.免疫組織化學(xué)染色所有病例的病理切片均行常規(guī)HE染色，及PCNA、Ki-67及Cyclin B1免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色方法采用SP法。 5.閱片同實驗Ⅰ。

8、6.統(tǒng)計學(xué)處理同實驗Ⅰ。 結(jié)果： 細(xì)胞周期蛋白含量與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶消退情況的相關(guān)關(guān)系： 以頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶在放射治療過程中體積縮小25％、50％、75％及完全消退所需的放射劑量代表其放射敏感性，即所需的放射劑量越小，放射敏感性越高。在Spearman等級相關(guān)分析中，細(xì)胞周期蛋白PCNA及Ki-67的含量與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶消退過程中所需放射劑量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，即與放射敏感性呈正相關(guān)關(guān)系，而細(xì)胞周期蛋白Cy

9、clin B1的含量與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶消退過程中所需放射劑量無相關(guān)性(P>0.05)。 討論： 本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織內(nèi)PCNA含量不同，其頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的放射敏感性也明顯不同，二者呈正相關(guān)關(guān)系。這可能是因為PCNA作為細(xì)胞增殖的主要標(biāo)記物與細(xì)胞增殖率明確相關(guān)，而細(xì)胞增殖率又與腫瘤放射敏感性呈正相關(guān)關(guān)系。 本研究中細(xì)胞周期蛋白Ki-67含量與鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的放射敏感性呈正相關(guān)關(guān)系，符合增殖率高的腫瘤放射敏感性

10、高的規(guī)律。 結(jié)論： 本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中異常P53蛋白和bcl-2基因表達程度與鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的放射敏感性成負(fù)相關(guān)關(guān)系，PCNA和Ki-67蛋白含量與鼻咽癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的放射敏感性成正相關(guān)關(guān)系，而細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1含量與其無關(guān)。由于頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶病理類型同源，所以異常P53蛋白、bcl-2基因表達程度及PCNA、Ki-67蛋白含量可以預(yù)測鼻咽癌的放射敏感性，準(zhǔn)確性高于通過腫瘤分化程度來判定其

11、放射敏感性的方法。 近年來發(fā)現(xiàn)，干擾素α不單具有腫瘤細(xì)胞毒性作用，還具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡及調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖周期的作用。由于腫瘤細(xì)胞的放射敏感性與細(xì)胞在增殖周期各時相的分布密切相關(guān)，干擾素α可能會改變腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。目前國內(nèi)外尚未見到干擾素影響鼻咽癌放射敏感性的研究報道。本實驗采用細(xì)胞集落形成方法來研究重組人干擾素α-2a對人鼻咽癌細(xì)胞系CEN-1放射敏感性的影響。 實驗材料： 1.培養(yǎng)細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞系CN

12、E-I。 2.藥物重組人干擾素α-2a(IFNa-2a)。實驗前將藥物用PRMI1640培養(yǎng)液配制成所需的濃度(0.5×103IU/m1，1.0×103IU/ml，1.5×103IU/ml)。 3.主要設(shè)備FACS can流式細(xì)胞儀。二氧化碳培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，直線加速器。 實驗方法： 1.IFNα-2a對CNE-I細(xì)胞放射敏感性的影響： 將培養(yǎng)瓶內(nèi)對數(shù)生長期的CEN-I細(xì)胞胰酶消化，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)

13、，逐級稀釋后將細(xì)胞接種于6cm平皿中。 將其分成四組進行實驗：(1)對照組不做任何處理；(2)單純用藥組分別加入含IFNα-2a 0.5×103IU/ml、10.×103IU/ml及1.5×103IU/ml的培養(yǎng)基5ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，立即除去藥物，繼續(xù)培養(yǎng)14天；(3)單純放射組使用6MVX線分別照射1、3、5、7、9Gy，照射后繼續(xù)培養(yǎng)14天；(4)藥物加放射組不同濃度IFNα-2a作用24小時后進行照射，條件同(2)

14、、(3)。培養(yǎng)14天后計數(shù)細(xì)胞集落數(shù)。計算細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞存活曲線。根據(jù)細(xì)胞生存曲線計算IFNα-2a在lO％存活率水平時的放射增敏比。 2.IFNα-2a對CNE-I細(xì)胞增殖周期的影響： 將培養(yǎng)瓶內(nèi)對數(shù)生長期的CNE-I細(xì)胞胰酶消化。將其分成二組進行實驗：(1)對照組不做任何處理；(2)用藥組加入含IFNα-2a 1.0×lO3IU/nd的培養(yǎng)液5ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后立即除去藥物，繼續(xù)培養(yǎng)。分別取對照組和除去藥

15、物后培養(yǎng)0、24、48h用藥組的培養(yǎng)細(xì)胞，消化并制成單細(xì)胞懸液。 DNA含量的檢測：常規(guī)方法用流式細(xì)胞儀檢測CNE-I細(xì)胞內(nèi)DNA含量，推算出細(xì)胞增殖周期中各時相細(xì)胞的分布。 結(jié)果： 1.IFNα-2a對CNE-I細(xì)胞放射敏感性的影響由細(xì)胞相對存活曲線可以測出在10％細(xì)胞存活水平時，0.5×103IU/Hd、1.0×103IU/ml、1.5×103IU/ml IFNα-2a作用24小時后的SER 分別為1.16、

16、1.61、1.85。 2.IFNα-2a對CNE-I細(xì)胞增殖周期的影響IFNα-2a作用于CNE-I細(xì)胞后24h，CNE-I細(xì)胞周期時間(46.6h)較對照組(38.8h)延長(P<0.05)，其中G1期時相(23.3h)延長和S期時相(4.2h)縮短與對照組(17.6h和6.9h)相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IFNo：-2a作用于CNE-I細(xì)胞后0、48h，CNE-I細(xì)胞周期各時相變化與對照組相比均不明顯(P>0.05

17、)。 討論： 本實驗發(fā)現(xiàn)，1.0×103IU/ml IFNα-2a作用后24h，CNE-I細(xì)胞增殖周期S期時間較對照組縮短，有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗還發(fā)現(xiàn)隨著IFNα-2a濃度的增大，人鼻咽癌細(xì)胞CNE-I放射后的生存曲線形狀發(fā)生變化，直線部分的斜率增大，說明IFNα2a具有一定的放射增敏效應(yīng)，且IFNα-2a放射增敏效應(yīng)呈濃度依賴性。這可能與IFNα作用于CNE-I細(xì)胞后，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖周期S期縮短，使處于放射抵抗的