MiR-566調(diào)控VHL影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)的體內(nèi)外研究.pdf

1、人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，它具有高度血管化的特征，患者中位生存期一般不超過12個(gè)月。盡管人類在癌癥的生物學(xué)研究和治療方面取得了很大的進(jìn)展，但是，我們對(duì)膠質(zhì)瘤這種惡性程度較高的腫瘤的研究尚未深入，其確切的發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，臨床上治療以手術(shù)切除為主，術(shù)后再加以放化療以及免疫治療等，總體治療效果較差，腫瘤復(fù)發(fā)率高。因此，探討膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有十分重要的意義。
　　MiRNA（MicroRNA）

2、是一類非編碼 RNA，它是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的，具有調(diào)控功能，其大小長約20~25個(gè)核苷酸【1】,它參與多種調(diào)節(jié)途徑，例如發(fā)育過程、造血過程、細(xì)胞增殖與凋亡等等【2、3】。研究表明，miRN A與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它可通過調(diào)控其靶基因參與的信號(hào)通路進(jìn)而在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮致癌或者抑癌的作用【1】，miRN A可作為今后膠質(zhì)瘤分子治療方向上一個(gè)新的突破點(diǎn)。
　　VHL（Von Hippel-Lindau）基因最早是由Vo

3、n Hippel【4】及Linda【5】發(fā)現(xiàn)，是一種重要的腫瘤抑制基因【6、7】,定位于3p25～26區(qū)【7】，編碼213個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，稱為VHL蛋白，VHL基因突變與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)，例如腎細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、胰腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管瘤等【8】，VHL與膠質(zhì)瘤之間的關(guān)系主要為 VHL可參與 HIF-1α泛素化降解的過程【9、10】進(jìn)而影響 VEGF（vascular endothelial growth factor）的表達(dá)，而

4、VEGF在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中是最為重要的血管形成因子【11】。VHL除了調(diào)節(jié)H IF-α水平和抗血管生成外，還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡【12】、細(xì)胞周期【13】、細(xì)胞外基質(zhì)的作用【14】。
　　我課題組前期研究工作提示VH L基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)降低，并與患者生存期存在負(fù)相關(guān)（尚未發(fā)表數(shù)據(jù)）,在對(duì)膠質(zhì)瘤患者的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-566與膠質(zhì)瘤發(fā)生、惡性程度、愈后密切相關(guān)【9】,生物信息學(xué)預(yù)測(cè)VHL基因受miR-566調(diào)控（www.

5、targetscan.org）。因此，在miR-566、VHL和VEGF之間可能存在某種調(diào)控關(guān)系，該種調(diào)控關(guān)系對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要的作用。本研究將探討miR-566調(diào)控VHL對(duì)人腦膠質(zhì)瘤中VEGF表達(dá)的影響,探尋新的有可能成為膠質(zhì)瘤治療的靶點(diǎn)，能夠?yàn)槟z質(zhì)瘤的綜合治療提供更新的有效的方法和思路。
　　本課題研究內(nèi)容將分為以下兩個(gè)部分：
　　第一部分為miRN A-566在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)控VHL影響VEGF表達(dá)的研究。

6、我們首先用表達(dá)反義miR-566的慢病毒（lenti-AS-miR-566）侵染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，采用Real time PCR檢測(cè)miRNA-566及VEGF mRNA的表達(dá)，采用Western blot檢測(cè) VHL、HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。其次用VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，Western blot檢測(cè)VHL、HIF-1α、VEGF蛋白的表達(dá)情況。最后采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-566與

7、VHL之間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示 lenti-AS-miR-566處理組 U87細(xì)胞中miRNA-566、VEGF mRNA和HIF-1α、VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低,VHL蛋白表達(dá)增高；VHL表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，VHL蛋白的表達(dá)增高；HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)下降，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示VHL是miR-566的調(diào)控靶點(diǎn)，表明 miRNA-566在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中可直接調(diào)控 VHL基因影響

8、HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞中V EGF的表達(dá)，并且對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性產(chǎn)生影響。
　　第二部分為構(gòu)建裸鼠顱內(nèi)模型，進(jìn)一步驗(yàn)證 miRN A-566在體內(nèi)調(diào)控 VHL影響VEGF的表達(dá)。用lenti-AS-miR-566處理后的U87細(xì)胞建立裸鼠顱內(nèi)模型，利用熒光原位雜交法（FISH）和免疫組織化學(xué)染色法對(duì)顱內(nèi)模型組織切片中miR-566和相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示組織切片中，熒光原位雜交證實(shí)處理組miR-566表達(dá)

9、減少，免疫組織化學(xué)染色證實(shí)處理組VEGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低，VHL蛋白表達(dá)增高，再次驗(yàn)證miRN A-566可直接調(diào)控VHL基因的表達(dá)進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤中VE GF的表達(dá)，并影響膠質(zhì)瘤的侵襲性。
　　結(jié)論：通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)和蛋白免疫印跡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了VH L基因是miR-566的靶基因,通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的研究，我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-566的表達(dá)可以使HIF-1α、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降