拉米夫定耐藥慢性乙型肝炎患者中新發(fā)現(xiàn)的HBV逆轉(zhuǎn)錄酶rtM204Q變異株的病毒學(xué)特點(diǎn)研究.pdf

1、我國(guó)有9300萬(wàn)慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染人群,慢性HBV感染可引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌,我國(guó)每年死于HBV感染相關(guān)疾病的患者約35萬(wàn)人。抗HBV治療是慢性乙型肝炎治療及阻斷其向肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌發(fā)展的重要手段,核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogs,NAs)是抗HBV治療的主要藥物,但隨用藥時(shí)間的延長(zhǎng),病毒的耐藥問(wèn)題已成為臨床抗HBV治療的棘手問(wèn)題。

2、1998年上市的拉米夫定(lamviudine, LAM)在我國(guó)有長(zhǎng)達(dá)13年的臨床抗HBV治療史,超過(guò)120萬(wàn)慢性乙型肝炎患者曾經(jīng)應(yīng)用LAM進(jìn)行抗病毒治療,由于該藥服用方便、安全,治療費(fèi)用相對(duì)低等優(yōu)點(diǎn),目前仍有大量患者在服用該藥。
　　HBV多聚酶缺乏校對(duì)活性,因此在病毒復(fù)制過(guò)程中容易產(chǎn)生錯(cuò)配,產(chǎn)生大量序列多樣性的病毒株,形成病毒準(zhǔn)種。在藥物選擇壓力下,對(duì)藥物適應(yīng)性強(qiáng)的病毒變異株可演變?yōu)閮?yōu)勢(shì)株,引起病毒耐藥。NAs的作用靶位在HB

3、V多聚酶的逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase, RT)區(qū),抑制病毒的復(fù)制。引起病毒耐藥的基因變異分為原發(fā)耐藥變異(primary resistance mutation)和補(bǔ)償變異(compensatory mutation):前者直接引起病毒對(duì)藥物敏感性的下降,主要是rtM204V和rtM204I,又被稱為 YMDD基序的YVDD和YIDD變異;后者補(bǔ)償出現(xiàn)原發(fā)耐藥變異病毒株下降的病毒復(fù)制力,主要是rtV173L和r

4、tL180M(常于rtM204V聯(lián)合出現(xiàn)), rtL80I(常于rtM204I聯(lián)合出現(xiàn))。HBV對(duì)LAM的耐藥發(fā)生率高,單獨(dú)用LAM治療1~4年病毒耐藥變異發(fā)生率分別為17％、40%、55%和67%。
　　隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng),用藥人群的不斷擴(kuò)大,以及在許多病例中的不合理用藥方式,出現(xiàn)新的或潛在LAM耐藥HBV變異株的可能性在增加。除經(jīng)典的rtM204I和rtM204V變異外,出現(xiàn)其他LAM耐藥相關(guān)變異的可能性也較大。近年,LAM治

5、療應(yīng)答不佳或無(wú)應(yīng)答的患者出現(xiàn)新的YSDD和YKDD變異株的臨床研究報(bào)道已引起學(xué)者的關(guān)注。因此,在臨床抗病毒治療過(guò)程中除檢測(cè)經(jīng)典耐藥變異外,發(fā)現(xiàn)與鑒定潛在HBV耐藥相關(guān)變異,對(duì)于全面認(rèn)識(shí)病毒耐藥與指導(dǎo)臨床合理調(diào)整抗HBV治療方案具有重要意義。
　　目的:研究臨床LAM長(zhǎng)期治療失敗的慢乙肝患者HBV RT區(qū)YMDD基序新變異rtM204Q的病毒學(xué)特點(diǎn),鑒定其與LAM耐藥的相關(guān)性。
　　方法:
　　1、從解放軍第三〇二醫(yī)院病

6、毒性肝炎研究室完成的大樣本HBV RT基因測(cè)定序列中,結(jié)合患者用藥、病毒學(xué)和生化應(yīng)答等臨床信息,篩選分析經(jīng)典耐藥變異以外的可能與LAM耐藥相關(guān)的潛在新的耐藥變異形式。
　　2、在篩選出的10例檢出HBV YQDD變異的服用LAM患者中,選取1例代表性接受LAM長(zhǎng)期治療卻失敗的慢乙肝患者樣本(PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢出其耐藥變異形式為 rtL180M+rtM204I/Q),提取血清HBV DNA,采用巢式PCR擴(kuò)增HBV全長(zhǎng)RT區(qū)基因

7、,PCR產(chǎn)物直接克隆到pGEM-Teasy載體中,隨機(jī)挑選40個(gè)克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定并分析耐藥相關(guān)變異。
　　3、采用定點(diǎn)突變方法將HBV1.1倍的pTriEX載體下游的Sph I酶切位點(diǎn)封閉,再用Xho I/Sph I雙酶切獲得改建后的pTriEX-1.1-HBV載體。將Xho I/Sph I雙酶切后的RT片段與載體連接成含HBV1.1倍基因組長(zhǎng)度的重組質(zhì)粒。
　　4、將構(gòu)建的含野生株和變異株的重組質(zhì)粒經(jīng)FuGENE?

8、HD轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4小時(shí)后加入不同濃度的核苷(酸)類藥物,隔天換藥,藥物連續(xù)作用4天后,收集細(xì)胞上清,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同藥物濃度下HBV DNA的復(fù)制水平,分析變異株對(duì)藥物的敏感性。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)以便驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1、共有10例慢乙肝患者檢出YQDD變異,進(jìn)一步研究的這例典型病例在LAM治療1年后出現(xiàn)病毒學(xué)突破,HBV DNA載量從陰性增加到1.88×106IU/mL,丙

9、氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)從正常水平增加到126U/L。對(duì)其HBV RT區(qū)分別進(jìn)行直接測(cè)序與克隆測(cè)序顯示,兩種檢測(cè)方法的結(jié)果一致,在獲得的37個(gè)克隆中,13個(gè)(35.1%)為野生型,11個(gè)(29.7%)為rtM204Q變異型,2個(gè)(5.4%)為rtM204I變異型,10個(gè)(27.0%)為 rtA181T變異型,1個(gè)(2.7%)為rtA181T+rtM204Q變異型。
　　2、定點(diǎn)突變成功改建pTriEX-1.1-HBV載體,獲得目的

10、載體片段。Xho I/Sph I雙酶切HBV RT區(qū)五種變異的片段及改建的載體,將兩者相連接。制備轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒。
　　3、分別將構(gòu)建的1.1倍HBV野生型和rtM204Q相關(guān)變異的四種變異型重組載體轉(zhuǎn)染入 HepG2細(xì)胞,檢測(cè)它們的復(fù)制力水平,野生病毒株的復(fù)制力為(6.00±0.096)×106 IU/mL,rtM204Q變異株、rtM204I變異株、rtA181T變異株和rtA181T+rtM204Q變異株與野生株比較均有不同程度

11、下降,分別是野生株病毒復(fù)制力的89.95%、46.28%、55.77%和34.44%。
　　4、在四種不同濃度的 NAs藥物作用下,評(píng)價(jià) rtM204I/Q在體外細(xì)胞中表型耐藥特點(diǎn)。三次獨(dú)立重復(fù)表型耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, rtM204Q和rtM204I變異株對(duì)阿德福韋(ADV)、恩替卡韋(ETV)和替諾福韋(TDF)敏感,但對(duì)LAM出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象,通過(guò)測(cè)定比較藥物的半數(shù)有效抑制濃度(IC50),rtM204Q、rtM204I株

12、對(duì)LAM的敏感性較野生株分別下降了75.7倍和1395倍。
　　結(jié)論:
　　1、在10例LAM用藥患者樣本的YMDD基序中檢出了與LAM耐藥高度相關(guān)的 YQDD變異,其中部分患者臨床表現(xiàn)出耐藥,提示該變異與LAM治療和耐藥存在一定的關(guān)聯(lián)。
　　2、病毒復(fù)制力測(cè)定表明,rtM204Q變異病毒株的病毒復(fù)制力雖然較野生株有所下降,但明顯高于經(jīng)典的rtM204I LAM耐藥病毒株。3、表型耐藥分析表明,rtM204Q變異病毒株