Rspo1和β-catenin在羅非魚卵巢分化、維持過程中的功能研究.pdf

1、長期以來，性別決定和性別分化在生殖生物學領域一直備受關注。曾經有一段時間科學家認為哺乳動物中卵巢的發(fā)育是一個默認和被動的過程。但最近對哺乳類研究發(fā)現(xiàn)，雌性性別決定也是由Foxl2、R-spondin1(Rspo1)、Wnt4和β-catenin等轉錄因子嚴格控制之下的多基因參與的分子級聯(lián)。哺乳動物性別決定是一個雄性的(Sry/Sox9/Fgf9)和雌性的(Rspo1/Wnt/β-catenin和Foxl2)信號通路的拮抗過程。表達數(shù)據(jù)暗

2、示Rspo1/Wnt/β-catenin信號通路可能參與黒鯛、青鳉、斑馬魚、羅非魚等硬骨魚類的性腺分化。硬骨魚類同時存在兩個β-catenin（簡寫為β-cat）基因，即β-cat1，β-cat2，并且它們編碼的氨基酸在N端以及中間的犰狳區(qū)域都很保守，而C端轉錄激活域差異較大，這種C端轉錄激活域的差異對β-cat轉錄激活靶基因能力有無影響，兩個β-cat在硬骨魚類性腺發(fā)育過程中又分別扮演什么角色都不清楚。為了更直接、更深入地研究Rspo

3、1/β-cat信號通路在硬骨魚類雌性性別分化過程中的作用，我們進一步研究了羅非魚Rspo1、β-cat1和β-cat2基因在性別分化早期的表達模式，借助TopFlash熒光素酶報告體系研究Rspo1、β-cat1和β-cat2激活靶基因能力，最后通過TALEN基因組編輯技術，從基因缺失的角度深入研究Rspo1/β-cat信號通路的功能。同時，我們表達并純化出該信號通路抑制因子Dkk1的重組蛋白，并用純化的Dkk1和該信號通路的化學抑制劑

4、FH535分別離體孵育羅非魚卵巢，檢測相關基因表達變化。本研究是首次在硬骨魚類通過基因敲降的在體實驗和離體孵育相結合的方式，直接證明該信號通路在雌性性別分化過程中的重要作用。具體結果如下：
　　1.鑒于硬骨魚類兩個β-cat氨基酸序列在C端轉錄激活域差異較大，我們分別將β-cat1缺失C端序列和β-cat2末端加入VP16激活域序列連入pcDNA3.1（β-cat1-C--pcDNA3.1，β-cat2-VP16-pcDNA3.1

5、），借助TopFlash熒光素酶報告體系，探討β-cat1和β-cat2激活靶基因的能力。結果發(fā)現(xiàn)β-cat1可以激活TopFlash熒光素酶表達，而Rspo1和β-cat2不能。但Rspo1能夠增強β-cat1激活的TopFlash熒光素酶表達。β-cat2卻可以通過與β-cat1發(fā)生相互作用而增強β-cat1激活的TopFlash熒光素酶表達；β-cat2-VP16可以激活熒光素酶的表達，而β-cat1-C-轉錄激活能力大大降低。<

6、br>　　2.熒光定量PCR結果顯示Rspo1、β-cat1和β-cat2在卵巢中從孵化后20天開始上調，結合前期的原位雜交和免疫組化數(shù)據(jù)，我們推測Rspo1、β-cat1和β-cat2可能參與羅非魚雌性減數(shù)分裂過程。
　　3.通過TALEN基因組編輯技術敲降Rspo1。與對照組相比，Rspo1敲降XX羅非魚性腺在孵化后2個月發(fā)育延遲，生殖細胞停留在卵原細胞階段，無卵母細胞。同時免疫組化實驗表明，與對照相比，Rspo1敲降性腺中V

7、asa陽性細胞減少，但Rspo1敲降不影響雌激素合成酶Cyp19a1a在性腺體細胞表達；到孵化后6個月，Rspo1敲降個體性腺發(fā)育得到恢復，與對照相比卻可以檢測到雄激素合成酶Cyp11b2和雄性支持細胞標記因子Dmrt1的表達，同時血清中雄激素（11-KT）水平顯著上調，而雌激素（E2）水平并沒有發(fā)生變化。
　　4.在孵化后60天，對照組卵巢中出現(xiàn)I、II時相卵母細胞，在β-cat1或β-cat2敲降60天的XX性腺，無I、II時

8、相卵母細胞的形成，生殖細胞停留在卵原細胞時期。免疫組化表明，與對照相比，在雌性個體敲降β-cat1或β-cat2不影響雌激素合成酶Cyp19a1a在性腺體細胞的表達；3月齡的β-cat1或2敲降雌魚出現(xiàn)I、II時相的卵母細胞，而性腺表現(xiàn)為雄性因子Dmrt1、Cyp11b2陽性，而對照卵巢檢測不到Dmrt1、Cyp11b2；到6月齡，β-cat1或2敲降雌魚卵巢發(fā)育趕上對照組，但此時的卵巢仍表現(xiàn)為 Cyp11b2陽性，同時血清中雄激素水平

9、比雌性對照高，但雌激素水平與對照沒差異。熒光定量PCR和Western blot結果表明，與對照比Foxl2、Dmrt1、Cyp11b2在β-cat1或2敲降雌魚性腺中上調，Cyp19a1a表達沒發(fā)生變化。
　　5.當用30μg/ml Dkk1重組蛋白或者50μM化學抑制劑FH535孵育180天羅非魚卵巢4天后，均引起β-cat1和2表達下調，foxl2、dmrt1、cyp11b2表達上調，而 cyp19a1a表達沒發(fā)生變化。同時

10、，免疫組化顯示，6月齡羅非魚卵巢經Rspo1/Wnt/β-catenin信號通路抑制劑FH535離體孵育4天后Cyp19a1a表達沒發(fā)生變化，F(xiàn)oxl2、Dmrt1和Cyp11b2表達上調。
　　綜上，在硬骨魚類中Rspo1可以激活β-cat1介導的信號通路，并在卵巢分化和維持中起重要作用；硬骨魚類中β-cat1和β-cat2通過協(xié)同作用發(fā)揮作用；這個信號通路在雌性個體中通過抑制雄性基因的表達和雄激素的合成而維持卵巢的雌性特征；盡