分子流行病學在疾病預防控制中的應用

1、分子流行病學進展及其在疾病預防控制中的應用Molecular Epidemiology and its Application in Disease Prevention & Control,沈 洪 兵 南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,分子流行病學的定義（Molecular Epidemiology）,分子流行病學是闡明疾病和健康狀態(tài)相關生物標志（或分子事件）在人群和生物群體中的分布及其影響因素，并研究防制疾病、促進健康的策略與

2、措施的科學。應用先進的技術測量生物學標志的分布情況，結合流行病學現場研究方法，從分子或基因水平闡明疾病的病因及其相關的致病過程。,,Cancer,,,傳統流行病學（宏觀、群體）,Exposure,傳統流行病學和分子流行病學,,傳統流行病學,分子流行病學,,傳統流行病學與分子流行病學的關系（EDC模型）（Schulte,1993）,暴露,疾病,Medical Practice etiology diagnosis treatme

3、nt prevention,分子流行病學？,Gene discovery &CharacterizationSNPsHaplotypes,,Human Genome ProjectHapMap Project,,,分子流行病學的特點,與傳統流行病學不同 研究的水平不同 所解決的問題不同 與分子生物學的區(qū)別 研究對象不同（人群） 研究內容和方向不同（強調與宏觀暴露的關系） 研究方法不同（流行病學思維和方法）

4、宏觀與微觀相結合！,分支 腫瘤分子流行病學 傳染病分子流行病學 ……,分子流行病學的發(fā)展趨勢 研究手段越來越多,技術越來越成熟研究內容(生物標志物)越來越豐富應用范圍越來越廣（病因、危險度評估、早期診斷、個體化治療）,生物標志（biological markers, biomarkers）是可以測量的、能代表生物結構和功能的大分子物質，如DNA、RNA (miRNA)或抗原、抗體、蛋白質（酶）等。,分子流行病學的主要研究內

5、容：生物標志,一、暴露標志（exposure marker）,（一）外暴露標志主要指環(huán)境因素暴露，包括生物性因素和非生物性因素1、生物性病原因子的鑒定2、病原生物進化變異規(guī)律（進化樹）3、環(huán)境化學污染物（非生物因素）暴露（二）內暴露標志1、傳染性疾病： 感染狀況、抗原抗體檢測、病原體基因監(jiān)測2、慢性非傳染性疾病 內暴露劑量、 生物效應劑量,內暴露劑量包括對化學毒物、飲食中的營養(yǎng)素和可能致癌劑以及微

6、生物感染的測定。例如：,吸煙 - 血或尿中的煙草代謝產物可替寧濃度（Cotinine）多環(huán)芳烴 - 尿中的1- 羥基芘水平飲食暴露- 黃曲霉毒素B1(AFB1)和尿中N-亞硝基化合物（ N - nitroso compounds）的濃度、血液中營養(yǎng)素水平工作暴露和環(huán)境污染 - 血清或脂肪組織中的殺蟲劑DDT（dichloro-diphenyl-trichloroethane）、多氯聯苯PCBs（polychlorinated

7、biphenyl）、二氧雜芑（Dioxins）環(huán)氧化物含量吸煙和環(huán)境污染 - 尿中的致突變因子（mutagenicity）的測定。,,,體內劑量標志,可替嚀（Cotinine）,香煙中的尼古丁,體液,鉛,環(huán)境中的鉛,體液和組織（發(fā)、指甲、牙齒）,二氯二苯二氯乙烯,二氯二苯三氯乙烷,脂肪組織,黃曲霉素,食物原料,體液,,二、效應標志（effect marker）,傳染病 酶學的改變，血液生化（免疫）指標的變化

8、 病原體基因的整合慢性非傳染性疾?。ㄎｋU性預測） 主要是基因毒性標志物，包括癌基因激活、點突變和染色體異常 基因表達異常和代謝異常 基因突變或染色體畸變,生物學效應標志,三、易感性標志（環(huán)境-基因）,（一）遺傳性疾病 HNPCC, BRCA1/2（二）慢性病（易感性分子標志物） DNA修復通路（肺癌、腸癌） 代謝酶系統（膀胱癌）（三）傳染病

9、 免疫系統（HLA） 炎癥通路,宿主易感性標志（非傳染病）,,,,傳染病慢性丙肝病人中，HLA-B44出現頻率高達30%以上對白喉毒素敏感的基因定位在5號染色體長臂對脊髓灰質炎病毒敏感性基因定位在19號染色體長臂,,,What is a SNP? 基因多態(tài)性,A mutation in the DNA sequence with a frequency of >1%,遺傳性多態(tài)性標

10、志物,人類基因組計劃研究結果表明，不同個體的基因99.9%是一樣的，但在序列上有極小(0.1%)的遺傳差異，其中主要是 SNP。 SNP是指在人群中出現的頻率?1%的先天突變。SNP存在于整個人類基因組中，可能每100~300bp就存在一個SNP，估計總數在數百萬個。 研究表明，正是這0.1%的差異授予你我他特有的表型；這個小小的差異還與個體對疾病(包括腫瘤)的易感性、對藥物的反應性差別有密切關系。,單核苷酸多態(tài)性(Singl

11、e nucleotide polymorphism, SNP),,,人類基因組計劃(HGP),,,基因組多態(tài)性數據庫(SNPs),Human Genome Project,Biology,Response,Disease,Prevention,Collins et al., Nature, 2003,人類基因組計劃,單核苷酸多態(tài)與人類個體差異,,單核苷酸多態(tài)與個體疾病易感性差異,,Cancer,,,Exposure,,Cancer-fr

12、ee,CIR by 70 yrsM: 15.9% F: 9.5%,(Peto, BMJ, 2000),Genetic susceptibility?,Screening, prevention,研究問題 1:,Why only < 20% smokers develop lung cancer?,SNPs？,NSCLC,,,,,No response,Response,Chemotherapy,SNPs & Che

13、mosensitivity,,SNPs？,,?,研究問題 2:,Why some lung cancer patients have no response to chemotherapy?,基因檢測-危險度評價,從科學研究?臨床實踐,人類基因組流行病學,1998年由Khoury和Dorman提出人類基因組流行病學(human genome epidemiology, HuGE)的概念，定義：應用流行病學與基因組信息相結合的研究方法

14、，開展以人群為基礎的研究，評價基因組信息（基因或基因變異及其相應編碼的產物）對人群健康和疾病的流行病學意義。,分子流行病學常用技術及方法,核酸技術（DNA & RNA）核酸體外擴增 （PCR）核酸電泳圖譜 核酸酶切電泳圖譜 （RFLP）擴增片斷長度多態(tài)性（AFLP）核酸分子雜交 有原位雜交、斑點雜交、轉印雜交（包括Southern blot檢測DNA和Northern blot檢測RNA）等。核酸序列分

15、析蛋白質技術 蛋白質分離鑒定技術主要有：電泳、凝膠電泳、蛋白質轉印雜交（Western blot）、色譜分析、蛋白質測序等。,酶學技術 包括定性和定量檢測，要求一定的條件。多位點酶電泳（multilocus enzyme electrophoresis, MEE）法。免疫學技術： 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、熒光免疫試驗（FIA）、放射免疫試驗（RIA）、免疫細胞化學檢測（ICC）等；色譜（質譜

16、）技術： 高效液相色譜技術HPLC）、液相蛋白色譜技術（FPLC）等。,PCR-RFLPPCR-SSCP, PCR-based resequencingReal-time PCRMatrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight (MALDI) mass spectrometryDynamic allele-specific hybridization

17、(DASH)DNA-chip analysisDHPLC,單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測技術,illumina 高通量基因分型平臺,SNPstream基因分型系統,Automated Liquid HandlerSpectroPREPTM,Nanoliter DispenserSpectroJETTM,MALDI-TOF Mass SpectrometerSpectroREADERTM,Automated AnalysisS

18、pectroTYPERTM,,,,Miniaturized BiochipSpectroCHIPTM,,,MassARRAYIntegrated Components,核酸分子雜交,,蛋白質檢測鑒定系統,,SDS-PAGE,酶聯免疫吸附試驗（ELISA）,高效液相色譜(HPLC, LC/MS/MS),Accessible Genome and GeneticVariation database,Affordable High-th

19、roughputPlatform Service,分子流行病學在疾病預防和控制中的應用,（一）病因的探討及病因致病機制的研究 1、傳染病病因及流行規(guī)律的探討 研究已知或新發(fā)傳染病的病原體和流行特點 病原學診斷（基因診斷）、基因分型 研究分布特點，傳染源追蹤和傳播途徑確定 觀察病原體在體內持續(xù)時間和消長規(guī)律,,丙型肝炎病毒基因分型,Simmonds雙等級基因命名系統,病原體基因分型,不同基因型HCV，其臨床表現以及

20、對抗病毒治療的敏感程度有顯著差異。1b型對干擾素治療的持續(xù)應答率為20%，而非1b型對干擾素治療的持續(xù)應答率可達60-70%。,1a, 1b 2a, 2b, 3a,1a, 1b 2a, 2b, 2c, 3a,4,5a,1b,1b, 6,1b, 3a,1b, 3a,3b,4,Clinical Microbiology Reviews, 2000, 13(2) 223-235,HCV 1b型是我國主要

21、流行型,1a, 1b, 2b, 3a,2a,如SARS 在廣東流行可分三個階段:早期由病人分離到的SARS 病毒與果子貍分離到的SARS 病毒高度同源,因此懷疑SARS 是一種動物來源的疾病。,上海預防醫(yī)學雜志2005,SARS病毒來源及變異分析,中期SARS 病毒分子結構穩(wěn)定, 病毒傳播力強, 超級傳播事件發(fā)生多。后期SARS 病毒堿基缺失可達幾百個，病毒的傳播力大大減少。,案例：1990年7月，美國佛羅里達州一名AIDS婦女，

22、懷疑在當地一牙科診所手術時感染了HIV，因為該診所的牙科醫(yī)生也是一名AIDS患者。隨后當地衛(wèi)生部門對該牙醫(yī)診治過的一千余名患者進行HIV檢測，共發(fā)現7名HIV感染者有在該診所的就診史。那么這7名HIV感染者是否與該牙醫(yī)有關呢？,傳染病傳播途徑分析,Science 1992,針對這一問題可采取的分析方法：1、傳統流行病學分析方法：接觸者調查，分析感染者可能的危險行為如輸血、靜脈吸毒、不潔性交史等。2、分子流行病學方法：比較HIV病

23、毒基因序列的差異，分析不同病例感染株遺傳關系的遠近。,Science 1992,,,與牙醫(yī)感染株的遺傳變異性比較,與對照感染株的遺傳變異性比較,,,病人D,,當地對照,,牙醫(yī)及病人A,B,C,E,G,,病人F,進化樹分析,以結核為例：與結核病人密切接觸，感染和發(fā)病的危險增加。這些接觸者與源病例之間，是否產生了結核分枝桿菌的傳播？開展結核病成“簇”性研究，可以從分子角度解答這樣的問題。成簇的過程就是用聚類分析對分離株的基因進行分型或分

24、群的過程，可以分析結核病的傳染源和傳播途徑。,揭示傳染病傳播機制,結核桿菌DNA指紋圖譜有助于基因分型,流行病學常用結核桿菌基因分型方法IS6110-RFLPSpoligotyping MIRU-VNTR,Bauer等對丹麥1549株結核菌進行IS6110為基礎的DNA指紋分析，成簇率49%。同樣方法檢測格陵蘭島成簇率為79%。,J Clin Microbiol,1998,,,Beijing家族結核菌株在全球的分布,江蘇省北部

25、地區(qū)(蘇北) 在2003年1-7月爆發(fā)了較大規(guī)模的無菌性腦膜炎,涉及范圍之廣、發(fā)病人數之多,在國內較少見。,不明原因疾病爆發(fā)調查,疾病暴發(fā)原因分析,問卷調查收集基本資料血清學檢測病原體分離培養(yǎng),Echo30 型腸道病毒感染,,病毒序列測定和比對,,均為Echo30型腸道病毒。進化樹分析顯示分離株與國外1999年和2000年分離株的親緣關系最近；但自成一簇，與國外毒株存在地區(qū)差別。,,2、非傳染病的病因及病因致病機制的研究 例：載

26、脂蛋白與心血管疾病 HBV感染與肝癌（基因組整合） EBV感染與鼻咽癌 HPV感染與宮頸癌 HP感染與胃癌,心腦血管病的研究 載脂蛋白與心血管疾病 四組老年人apooA-I、apoB-100與apoA-I/apoB-100比值人群類別 檢測例數 apoA-I（mg/dl） apoB-100（mg/dl） apoA-I/apoB-100 對照組

27、 85 148.2±30.1 97.3±28.3 1.58±0.8冠心病組 146 141.6±51.9 113.9±35.8** 1.40±0.7**高血壓組 90 135.1±32.

28、9* 107.0±59.2** 1.44±1.07**高血壓并冠心病組,57 140.2±31.3 110.9±34.2** 1.41±0.8**,,,注：病例組與對照組相比*P<0.05；**P<0.01,,,,HBV肝癌,正常人,HBV感染,正常:HBV肝癌,AUC: 99

29、.9±0.1%,2/5,靈敏度:0.969,特異度:0.994,HBV:HBV肝癌,AUC: 99.2±0.6%,,MiRNA 譜(Profile),,例：惡性腫瘤的形成過程及其影響因素,,,,,,,,,前致癌物,終致癌物,DNA損傷,基因突變,癌前病變,惡性腫瘤,,,,,,遺傳易感性因素,（二）疾病易感性的測定 （傳染病和非傳染病）,測定疾病易感性，可以進行高風險人群篩選，采取更有效的預防和控制措施

30、 高危險易感基因（高外顯性） 連鎖研究(linkage!) 如BRCA1、BRCA2與乳腺癌（40-80％） 一般人群中頻率<1％，RR和AR高，PAR較低！ 低危險易感基因（低共顯基因） 相關性研究（association?。?如代謝酶基因（I相、II相） DNA修復基因 細胞周期調節(jié)基因等,,,Smoking Caused DNA Damag

31、e and Related Repair Pathways,DNA repair gene SNPs （genotypes）,DRC（Phenotype）,Lung Cancer Risk,,Hypothesis:,,The genetic polymorphisms of the DNA repair genes are associated, independently or coordinately, with incre

32、ased risk of lung cancer,Gene-environment interaction?,Subjects & Methods,Hospital-based case-control studies of lung cancer Inclusion Criteria Cases: Incident lung cancer patients Newly diagnosed,

33、histopathologically confirmed No previous radiotherapy or chemotherapy Controls: Cancer-free subjects Recruited at the same time period as cases and frequen

34、ted matched to the cases on age, sex All the subjects are Han Chinese (Nanjing).,Potentially functional SNPs of DNA repair gene XRCC1 and risk of lung cancer,Hu Z, … Shen H. Pharmacogenetics & Genomics 2005 15(7

35、): 457-64.,A case-control study of 710 lung cancer cases and 710 cancer-free controls,Example 1,Functional polymorphisms of DNA repair gene XRCC1:Promoter: T-77C (2004)Coding region: Arg194Trp (C>T)

36、 (DNA pol?, PARP domain ) Arg399Gln (G>A) (PARP domain),1246-bp,57–64%,Distribution of Select Variables and XR

37、CC1 Variant Alleles in Lung Cancer Cases and Cancer-free Controls,XRCC1 T-77C Polymorphism and Lung Cancer Risk,Hu Z, … Shen H. Pharmacogenetics & Genomics 2005 15(7): 457-64.,XRCC1 T-77C and Cumulative Smoking,Pack-

38、years of smoking,-77TT -77CT/CC,Adjusted OR,Hu Z, … Shen H. Pharmacogenetics & genomics 2005 15(7): 457-64.,P value for the test of additive gene-smoking interaction: 0.027,This significant association with l

39、ung cancer was validated in another independent case-control study in a Chinese population,Hao et al. 2006 Oncogene,,,,,,GWAS,（三）疾病防治措施的研究,1、傳染病的預防 （1）新疫苗的研制—核酸疫苗（2）研究疫苗預防效果—與疫苗無應答的關系，如對乙肝疫苗低應答或無應答人群中，白種人和日本人攜帶HLA-DR3和

40、HLA-DR7比率較高；而中國人HLA-DR14-DR52基因的攜帶率較高 （3）疫苗株引起的感染,2、非傳染病的防治作為抗氧化劑的胡蘿卜素可減少或防止DNA的損傷葉酸可改變DNA甲基化或減少染色體斷裂,（四）疾病診治效果和預后評價,1、治療效果評價 從分子水平研究藥物治療后體內某些指標的變化情況（傳染病和非傳染病）2、疾病預后的評價 胃癌病人nm23基因、P27KIPI基因、TGF-BRI基

41、因表達與生存率的關系，結果發(fā)現，癌組織內上述基因高表達組手術后3年和5年生存率均高于低表達組或陰性組,我國2000年全國流調結核菌耐藥狀況,初始耐藥：18.6% 初始耐多藥率：7.6%獲得性耐藥：46.5% 獲得性耐多藥率：17.1%總耐藥：27.8% 總耐多藥率：10.7%,miR-196a2 rs11614913 多態(tài)性與肺癌生存率 (CC vs

42、 CT/TT),Hu Z …Shen H. Journal of Clinical Investigation, July, 2008IF=16.9,(A) MMP9 Arg279Gln and NSCLC survival (P = 0.03); (B) MMP9 Arg668Gln genotypes and NSCLC survival (P = 0.01); (C) Combined effect of MMP9 Arg2

43、79Gln and Arg668Gln on NSCLC survival (P = 0.007),Arg279Gln,Arg668Gln,A,B,C,Jin G…Shen H. Int J Cancer, 2009,The 4 miRNAs Expression and NSCLC Patients’ Survival of all Sample Sets,Risk Score Analysis of 303 NSCLC Patien

44、ts,Each patient was assigned a risk score according to a linear combination of the expression level of the miRNA, weighted by the regression coefficients from the training samples,分子流行病學研究中需要注意的問題,1、重視宏觀流行病學研究設計（研究設計類型、樣

45、本量?。?、重視暴露因素和危險因素的收集和利用，提高研究質量和水平（很多時候缺乏環(huán)境暴露的評估和環(huán)境－基因交互作用的分析；）3、分子標志物的檢測同樣要防止偏倚的產生（假陽性），注意重復性（大樣本多中心）和生物學合理性4、分子流行病學亦存在流行病學的許多局限性,小 結,分子流行病學產生的原因？ （流行病學)實踐的需求是學科發(fā)展的根本動力。分子流行病學怎樣產生？ 學科分化、交叉和融合產生新的學科或學科分支。 分子生物學提供了條

46、件。,分子流行病學是什么? 闡明人群和醫(yī)學相關生物群體中生物標志的分布及其與疾病/健康的關系和影響因素，并研究防治疾病、促進健康的策略與措施的科學。,分子流行病學做什么？ 暴露測量及其與疾病的關系 效應測量及其與疾病的關系 易感性測量及其與疾病的關系 生物標志（測量指標）的研究,分子流行病學怎么做？ 研究目的 測量指標選定 測量方法選定：分子生物學技術 研究設計：流行病學調查研究方法 資料處理分析及質量控制